Gangliósidos en la alimentación infantil. Determinación, biodisponibilidad y efectos biológicos

Laburpena

La leche materna es considerada como el alimento más completo y adecuado durante las primeras etapas de vida. Cuando la lactancia materna no es posible, o resulta insuficiente, se recurre a los preparados destinados a la alimentación infantil (PI) , cuya composición tiende a asemejarse a la leche humana. Actualmente, se están intentando mejorar los PI mediante el estudio de compuestos bioactivos, encontrándose dentro de estos compuestos el ácido siálico (Sia) y gangliósidos (GG). El objetivo de esta tesis es el estudio del Sia y GG en preparados destinados a la alimentación infantil comerciales. En concreto, se trata de conocer la composición en Sia y GG de preparados destinados a la alimentación infantil y su comparación con la leche humana (LH), estimar la bioaccesibilidad de Sia y GG, y conocer el efecto de Sia y GG presentes en PI y LH sobre la inhibición de la adhesión de bacterias patógenas implicadas en la diarrea del lactante y en su respuesta immune. Se ponen a punto y validan 2 métodos para la determinación de Sia en PI: espectrofotometría de absorción molecular (EAM) y HPLC-fluorescencia. Con los resultados obtenidos se puede afirmar que ambos métodos son adecuados para su aplicación a preparados infantiles y leche humana. Los métodos validados se aplican a PI comerciales, sueros lácteos ricos en ¿-lactoalbúmina (SA) y membranas de glóbulos grasos de la leche (SB) y LH. Así mismo, se determina el contenido y perfil de gangliósidos en la mismas muestras mediante EAM (expresado como ácido siálico unido a lípidos) y HPTLC-densitometría, no alcanzando ninguna de las muestras analizadas alcanzan los niveles de ácido siálico y gangliósidos presente en la LH. La bioaccesibilidad del Sia y GG se evalúa tras una digestión gastrointestinal simulada en 2 etapas (gástrica e intestinal). La etapa gástrica es la etapa que más disminuye la presencia de ambos compuestos durante dicha digestión, no observando presencia de los mismos en la fracción insoluble. Para el Sia, la mayor bioaccesibilidad la presenta la LH, mientras que en los GG se halla en el preparado de continuación conteniendo el suero SB en su formulación. Se caracterizan los contenidos y perfiles de Sia en la línea celular Caco-2, así como la localización celular de los 2 GG mayoritarios (GM3, GD3). Tanto el contenido de Sia como de GG totales es mayor en células diferenciadas vs. no diferenciadas (2 y 3 veces mayor, respectivamente). El GG mayoritario siempre es el GM3, seguido del GM1 y GD3 en células no diferenciadas y diferenciadas. Los GG se encuentran localizados de forma específica en las células Caco-2: GM3 en la membrana apical y GD3 en la basolateral. Se evalúa la citotoxicidad (viabilidad celular, actividad mitocondrial y actividad lisosomal) y el efecto en la adhesión de bacterias patógenas (ensayos de competición, desplazamiento y exclusión) de los principales GG y Sia a las concentraciones mayores y menores en las fracciones solubles de las muestras analizadas en las células Caco-2. No se observa ningún efecto tóxico en las condiciones ensayadas, siendo el ensayo de exclusión el menos sensible a la presencia de Sia y GG y el GG GD3 el más efectivo en todos los casos. Se ensaya con el extracto GG de un preparado para lactantes y otro de continuación, ajustando su concentración a la hallada en sus fracciones solubles, los mismos ensayos de adhesión y la expresión y secreción de IL-8 en las células Caco-2 tras inducir un proceso inflamatorio con 2 cepas de E. coli (patógena y no patógena) (ensayos de pre-incubación y presencia de GG antes, durante y después de la inducción). La muestra con mayor contenido en GD3 presenta mayor efecto en la inhibición de la adhesión; los resultados en los ensayos de inflamación sugieren que los GG pueden actuar como compuestos antiinflamatorios inhibiendo los receptores TLR, pudiendo no actuar sobre la ruta de NF-¿B.