Degradación de aminas biógenas mediante sistemas microbianos. Identificación y caracterización de las enzimas responsables

Resumen

Las aminas son compuestos ampliamente presentes en la naturaleza que contienen uno o varios sustituyentes unidos a un átomo de nitrógeno. Son compuestos endógenos de las plantas que también pueden encontrarse en frutas frescas y verduras. Sin embargo, en los alimentos, las aminas se forman fundamentalmente en los procesos fermentativos, y durante el envejecimiento y la conservación. Las aminas biógenas (AB) se originan por la descarboxilación microbiana de los correspondientes aminoácidos precursores, por ello se denominan ‘biógenas’. Entre las AB, las más estudiadas son la histamina y la tiramina por sus implicaciones negativas para la salud. Están presentes en numerosos alimentos tales como queso, vino, cerveza, vegetales, pescado y carnes rojas, entre otros, y son consecuencia de un proceso normal de fermentación o de una alteración microbiana. Las AB más comunes y con mayor prevalencia en alimentos son la histamina, tiramina y putrescina entre otras. La importancia del estudio de las AB en la industria alimentaria se debe a 2 razones principales, en primer lugar, si se ingieren en grandes cantidades pueden inducir efectos tóxicos. Por ejemplo, el consumo de alimentos con altos niveles de tiramina e histamina se asocia con desórdenes fisiológicos, tales como sensación de ardor en la garganta, rubor, dolor de cabeza, náuseas, hipo o hipertensión arterial, adormecimiento y hormigueo de los labios, pulso rápido y vómitos. La histamina produce, además, reacciones pseudoalérgicas. En segundo lugar, ciertas AB están implicadas en la formación de nitrosaminas carcinogénicas. Finalmente, el nivel de AB puede constituir un buen indicador químico de calidad o del grado de descomposición de los alimentos, como han sugerido varios investigadores. Si bien la histamina es la amina biógena que presenta un mayor potencial tóxico seguida por la tiramina, la presencia de otras AB, como la putrescina o la cadaverina, puede potenciar sus efectos tóxicos. En circunstancias normales el organismo humano es capaz de degradar las AB ingeridas con los alimentos mediante varias enzimas: monoamino oxidasa (MAO, EC 1.4.3.4), diamina oxidasa (DAO, EC 1.4.3.6), y poliamina oxidasa (PAO, EC 1.5.3.11). Pero se debe tener en cuenta que estos mecanismos de desintoxicación pueden no ser capaces de eliminar adecuadamente las AB ya que su efecto puede verse limitado debido a distintos factores: genéticos, alérgicos, ingesta excesiva de aminas, o consumo de medicamentos inhibidores de algunas de estas enzimas, como es el caso de los antidepresivos que inhiben a las MAO. Además, factores como el consumo de bebidas alcohólicas pueden aumentar el potencial tóxico de las AB, al favorecer el transporte de las mismas a través de la pared intestinal. La alta concentración de AB satura las enzimas degradadoras lo que impide que estas desaparezcan totalmente del organismo. La síntesis de AB es llevada a cabo por enzimas específicas, llamadas descarboxilasas. El proceso de descarboxilación enzimática depende de varios factores tales como la disponibilidad de aminoácidos en forma libre, la presencia de microorganismos productores de enzimas descarboxilasas y la existencia de condiciones adecuadas en el sustrato para que los microorganismos crezcan y lleven a cabo la descarboxilación. Los aminoácidos precursores o están presentes de manera natural en el alimento crudo o son producidos vía proteólisis por proteasas endógenas de los mismos o por proteasas excretadas por los microorganismos. Los microorganismos productores de descarboxilasas pueden formar parte de la microbiota natural presente en los alimentos, de los cultivos iniciadores utilizados para su fermentación o de la microbiota alterante. El vino es el producto de fermentación del mosto de uva en el que las levaduras fermentan los azúcares para formar etanol mediante la fermentación alcohólica. La mayoría de vinos se someten a una segunda fermentación (la fermentación maloláctica, FML), que consiste en la transformación del ácido málico en ácido láctico. Este proceso disminuye la acidez del vino y mejora su sabor. La FML es llevada a cabo por bacterias lácticas (BAL) y la especie que generalmente se asocia a la misma es Oenococcus oeni, aunque también se han descrito otras como responsables de la misma (Lactobacillus plantarum, y algunas especies de Pediococcus). En el vino se han identificado más de 20 AB diferentes, algunas como la putrescina y espermidina pueden estar presente en la uva, mientras que estas dos y otras se pueden formar durante la fermentación. En el vino, las AB más comunes son histamina, tiramina, putrescina, cadaverina, espermina y espermidina. Los microorganismos responsables de la formación de AB durante la fermentación son las BAL. Se ha descrito que Oenococcus oeni es la especie con un mayor porcentaje de cepas (80%) que poseen el gen hdc, que codifica para la enzima responsable de la síntesis de histamina. Afortunadamente, estas cepas suelen tener actividades de histidina descarboxilasa bajas y no contribuyen demasiado a aumentar la cantidad de histamina en el vino. Por el contrario, algunas cepas Pediococcus parvulus y Lactobacillus hilgardii pueden llegar a producir entre 40 y 50 mg/L en el vino. Algunos lactobacilos y leuconostocs, también pueden producir cantidades intermedias de histamina. Se han encontrado cepas de Lactobacillus brevis y L. hilgardii que producen tiramina, mientras que se ha descrito la síntesis de putrescina en cepas de O. oeni, L. hilgardii y Leuconostoc mesenteroides. En el caso de la putrescina y la cadaverina, el problema no es tanto sanitario como organoléptico, ya que estas aminas provocan aromas desagradables. La putrescina provoca el aroma a putrefacción, y la cadaverina a trapo de cocina sucio entre otros. En los vinos la presencia de estas dos AB disminuye la percepción de los aromas propios del vino. La concentración de AB en el vino es menor que en otros alimentos fermentados. Su contenido varía desde trazas hasta niveles de 130 mg/L. Sin embargo, pese a estar en menor concentración que en otros alimentos, su toxicidad es mayor debido a que el alcohol potencia la toxicidad de las AB. A nivel comercial, la presencia de AB en los vinos compromete la exportación de los mismos a aquellos países que han impuesto límites para la concentración de histamina en los vinos. Las acciones preventivas para evitar la presencia de AB en el vino serían la limitación del nivel de aminoácidos precursores, la inhibición del crecimiento de las bacterias nativas y el uso de cultivos iniciadores malolácticos que carezcan de enzimas descarboxilásicas. La limitación del nivel de precursores se consigue disminuyendo el tiempo de maceración del mosto con los hollejos, evitando la adición de N2 orgánico para potenciar el crecimiento de las levaduras y evitando el contacto con las lías. El control del desarrollo de las bacterias nativas se aborda mediante el uso del dióxido de azufre (SO2), el agente antimicrobiano más utilizado en las bodegas. La utilización de cultivos iniciadores malolácticos no productores de AB evitan que aumenten los niveles de las mismas durante la FML y previene el desarrollo posterior de bacterias autóctonas que puedan sintetizarlas. Sin embargo, algunas de estas estrategias no se pueden aplicar al vino o tienen una eficacia limitada, como ocurre con el uso de SO2. Estas circunstancias, unidas al hecho de que las enzimas descarboxilasas pueden continuar activas en el vino incluso cuando la bacteria está muerta hacen que las medidas preventivas no sean suficientes para eliminar las aminas del vino. Se requiere por tanto del desarrollo de estrategias paliativas que puedan ser aplicables cuando las preventivas no han conseguido disminuir suficientemente la concentración de AB en vino. El objetivo principal de esta Tesis es la búsqueda de estrategias para la eliminación de AB mediante el uso de sistemas microbianos o enzimáticos. Este objetivo general se desglosa en los siguientes objetivos específicos: 1. Búsqueda de cepas bacterianas de origen alimentario, capaces de degradar aminas biógenas. 2. Aislamiento, purificación e identificación de las enzimas responsables de la degradación de aminas biógenas. Determinación y caracterización de la actividad de la enzima purificada de Kocuria varians LTH 1540. 3. Clonaje y la caracterización de las enzimas degradadoras de aminas biógenas de Lactobacillus plantarum J16 CECT 8944 y de Pediococcus acidilactici CECT 5930. 4. Aplicación de sistemas biológicos para degradar aminas biógenas en vinos. Para seleccionar bacterias capaces de degradar aminas, se obtuvieron extractos celulares de las mismas mediante disrupción mecánica y se investigó la presencia de enzimas degradadoras de AB en los mismos mediante un ensayo en gel de poliacrilamida. Las proteínas separadas de esta manera se hacían reaccionar en un tampón fosfato que contenía una mezcla de histamina, tiramina y putrescina, peroxidasa de rábano (HRP) y diaminobenzidina (DAB). De los 77 extractos de BAL probados, 40 de ellos (el 52,6 % de las mismos) y el de Kocuria varians dieron reacción positiva frente a la mezcla de las tres aminas. Las cepas que presentaron una reacción positiva frente a las aminas pertenecían a las especies: Enterococcus faecium, Lactobacillus brevis, Lactobacillus collinoides, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus farciminis, Lactobacillus hilgardii, Lactobacillus mali, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus pentosus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus vini, Pediococcus acidilactici, Pediococcus parvulus y Pediococcus pentosaceus, además de Kocuria varians. Cuando en el tampón de reacción del ensayo en gel se sustituyeron las AB por 2,6-dimetoxifenol (DMP), un sustrato típico de las lacasas, el número de extractos que mostraron una reacción positiva fue de 47; es decir, 7 extractos actuaron sobre el DMP pero no dieron reacción con las aminas. Todos los extractos que mostraron actividad sobre las aminas también lo hicieron sobre el DMP, excepto los de E. faecium y el de K. varians. A partir de estos resultados se analizó el comportamiento de las cepas cuyos extractos dieron una reacción más rápida e intensa en el gel tanto en medio de cultivo como en vino. De las 14 cepas seleccionadas, 13 pertenecían al grupo de las bacterias lácticas y procedían de cereales, vinos, salchichas, y pasta fermentada. La otra cepa pertenecía a la especie K. varians y procedía de productos cárnicos fermentados. Todas las cepas ensayadas degradaron dos o más aminas tanto en medio sintético como en vino, aunque con diferentes eficiencias, a excepción de K. varians LTH 1540 que degradó solo la putrescina. Las cepas que degradaron AB pertenecían a las especies: Enterococcus faecium, Lactobacillus brevis, Lactobacillus collinoides, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus farciminis, Lactobacillus hilgardii, Lactobacillus mali, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus pentosus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus vini, Pediococcus acidilactici, Pediococcus parvulus y Pediococcus pentosaceus, además de Kocuria varians. Todas las cepas de Lactobacillus plantarum y las cepas Pediococcus acidilactici CECT 5930 y Lactobacillus delbrueckii CECT 286 degradaron histamina, tiramina y putrescina en los dos medios, mientras que, Lactobacillus farciminis CRL 678 y Enterococcus faecium C1 sólo degradaron dos aminas, esta última cepa únicamente en medio sintético. Lactobacillus paracasei ENOLAB Lb 444 únicamente degradó histamina en medio sintético y Kocuria varians LTH 1540 la putrescina, tanto en medio como en vino. Las cepas más degradadoras de AB en vino fueron: Lactobacillus plantarum J16, Lb 98, Lb 132, Lb 291 y la cepa Pediococcus acidilactici CECT 5930, que degradaron histamina, putrescina y tiramina, seguidas de Lactobacillus farciminis CRL 678 que actuó sobre tiramina y putrescina y, finalmente, Kocuria varians LTH 1540. Por otro lado con este experimento se observó que la capacidad para degradar AB era un carácter dependiente de cepa en las especies Lactobacillus brevis, Lactobacillus collinoides, Lactobacillus hilgardii, Lactobacillus mali, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus vini, Pediococcus parvulus y Pediococcus pentosaceus, mientras que todas las cepas de Lactobacillus plantarum presentaron capacidad para degradarlas. Se seleccionaron 3 de las cepas más degradadoras (L. plantarum J16 CECT 8944, P. acidilactici CECT 5930 y K. varians LTH 1540) para llevar a cabo la identificación de las enzimas responsables de la degradación de dichas aminas, para ello se purificaron las enzimas y se enviaron al servicio de proteómica de la Universitat de València para su análisis proteómico por MALDI-TOF MS. La purificación se llevó a cabo en tres pasos, primero se realizó un fraccionamiento con sulfato amónico, seguido de una cromatografía de intercambio aniónico en las tres cepas, en el caso de L. plantarum se requirió además una cromatografía de intercambio catiónico adicional. El tercer paso consistió en aplicar las enzimas purificadas en un gel de poliacrilamida en condiciones nativas. Las proteínas responsables de la degradación de aminas se revelaron por la reacción coloreada que se producía en el tampón de reacción en presencia de las tres aminas, peroxidasa de rábano y DAB. Una vez revelada la banda se extrajo del gel y se aplicó en otro gel SDS-page para conseguir un mayor grado de separación. Tras el revelado de esta segunda electroforesis mediante el procedimiento anterior, se escindió la banda coloreada para llevar a cabo su identificación. La concentración de proteína obtenida de las purificaciones de L. plantarum J16 fue 0.25 mg/mL, de la de P. acidilactici 11.5 mg/mL y de la de K. varians 2.8 mg/mL. Para llevar a cabo los análisis proteómicos, se realizaron digestiones con tripsina y los péptidos resultantes se identificaron mediante MALDI-TOF MS. El análisis de los péptidos significativos, llevado a cabo por el programa MASCOT, mostró que los péptidos obtenidos de la proteína aislada de L. plantarum J16 CECT 8944 coincidían con los de la proteína de división celular SufI, cuyo número de acceso es C6VK53. La secuencia de los péptidos cubría el 54 % de la secuencia aminoacídica de dicha proteína. La proteína SufI está clasificada en la base de datos “The laccase engineering database” (LccED) como una multicobre oxidasa (MCO) perteneciente a la subfamilia J (CueO bacteriana). Los péptidos obtenidos por digestión trípsica de la proteína aislada de P. acidilactici CECT 5930 cubrían un 36 % de la secuencia completa de una proteína identificada como una presunta MCO cuyo número de acceso es D2EK17. El análisis por MALDI-TOF MS de los péptidos de la proteína de K. varians LTH 1540 mostró que se trataba de una proteína ortóloga de la putrescina oxidasa (PuO) de las especies K. rosea y K. rhizophila, cercanas filogenéticamente a K. varians. Por lo tanto, la PuO de K. varians se clasificaría en el grupo de enzimas EC 1.4.3.10. En este caso, además, se corroboró la identidad de la proteína mediante identificación, por espectrometría de masas, del producto de reacción de la putrescina oxidasa: la ?1-pirrolina. La aparición de este compuesto indica que la enzima que cataliza la reacción es una putrescina oxidasa dependiente de flavina (PuO). En los dos primeros casos se trataba de un tipo de enzimas que no se había relacionado previamente con la degradación de AB. En el caso de K. varians se trataba de un enzima PuO, cuya actividad ya era conocida, sin embargo es la primera vez que se ha descrito la presencia de este enzima en la especie K. varians. La lacasa de L. plantarum degradó principalmente la tiramina y en menor grado histamina y putrescina, la de P. acidilactici únicamente la tiramina, y la PuO de K. varians degradó principalmente diaminas, concretamente, putrescina y cadaverina y, en menor grado poliaminas (espermidina), aunque fue incapaz de degradar monoaminas. Se identificaron los genes que codifican para estos enzimas en los genomas de las cepas L. plantarum J16 CECT 8944, P. acidilactici CECT 5930 y K. varians LTH 1540, para ello se han desarrollado cebadores específicos para amplificar una región interna de los genes de las proteínas resultantes de las identificaciones. Con estos cebadores se comprobó que todas las cepas de L. plantarum y P. acidilactici presentaban los genes codificantes de las proteínas MCO identificadas, del mismo modo la cepa de K. varians también presentaba el gen de la putrescina oxidasa. El tamaño de los fragmentos de amplificación obtenidos para L. plantarum, P. acidilactici y K. varians fueron 765, 485 y 773 pares de bases, respectivamente. Las secuencias nucleótidicas de estos fragmentos correspondían a las esperadas. Se caracterizaron bioquímicamente las enzimas identificadas de L. plantarum J16 CECT 8944, P. acidilactici CECT 5930 y K. varians LTH 1540. La baja cantidad de proteína obtenida a partir de la purificación de los extractos celulares de las dos primeras cepas requirió del clonaje de los genes codificantes de esas proteínas en E. coli. La expresión de ambas proteínas en condiciones estándar (37 ºC y agitación 250 rpm) no dio lugar a proteínas activas, por lo que hubo que optimizar el proceso de expresión. El procedimiento que garantizó mayor actividad de las proteínas consistió en a) la adición de Cu+2 durante el crecimiento o durante la fase inducción de las bacterias; b) la reducción de la temperatura y de la agitación (20ºC y 120 rpm durante 2 h durante la inducción; y c) la incubación de las células durante la inducción en condiciones de microaerofilia (cultivo estático durante 16 horas). En el caso de P. acidilactici también fue necesaria la coexpresión de los genes que codificaban para las chaperonas GroES y GroEL junto al de la proteína. Estas chaperonas ayudaron al correcto plegamiento de la proteína. De esta manera se obtuvo la cantidad de proteína activa necesaria para la caracterización bioquímica. Los resultados de la caracterización se detallan a continuación. La lacasa recombinante de L. plantarum J16 presentó una masa molecular de 62.5 kDa, un pH óptimo de 3.5 para el ABTS y de 7 para el DMP, y una temperatura óptima de 60ºC. Además, la proteína retuvo más del 60% de actividad a 70ºC durante 10 min. Las constantes cinéticas Km para el ABTS y DMP fueron 0.21 y 1.67 mM respectivamente, la Vmáx obtenida para el ABTS fue 0.54 U/mg y para el DMP fue 0.095 U/mg. La actividad de la enzima disminuyó en presencia de los compuestos semicarbazida, bipiridilo, fenantrolina y EDC. La lacasa recombinante de P. acidilactici CECT 5930 presentó una masa molecular de 60 kDa, un pH óptimo de 4 y una temperatura óptima de 28ºC para el ABTS. Esta proteína retuvo más del 80% de actividad a 60ºC durante 10 min. Las constantes cinéticas Km y Vmáx para el ABTS fueron 1.7 mM y 24.05 U/mg, respectivamente. La actividad de la enzima disminuyó en presencia de los compuestos semicarbazida, EDTA, SDS y EDC. La caracterización bioquímica demostró que a pesar de tratarse de enzimas pertenecientes al mismo grupo, las lacasas de L. plantarum y de P. acidilactici diferían en sus masas moleculares, en su rango de sustratos, en sus constantes cinéticas y en sus pH y temperaturas óptimas de actuación. En cuanto a la degradación de aminas, las lacasas recombinantes de L. plantarum J16 y P. acidilactici CECT 5930 diferían en el rango de sustratos sobre los que actuaban, ya que la primera degradó principalmente la tiramina y en menor grado histamina y putrescina, y la segunda sólo la tiramina. Se asemejaban en que la adición de 100 mM de CuCl2 al tampón de reacción aumentaba su actividad sobre la tiramina, además ambas presentaron una temperatura óptima de 28ºC y los dos mismos pH óptimos de actuación de 4 y 9.5 para la tiramina. Además, el ABTS actúa como mediador para las dos enzimas recombinantes aumentando considerablemente la degradación de tiramina. Por otro lado también se caracterizó la enzima nativa obtenida de K. varians LTH 1540, la enzima purificada presentó una masa molecular de 43 kDa, un pH óptimo de 8.5 y una temperatura óptima de 45ºC para la putrescina. Esta enzima retuvo más del 50% de actividad a 55ºC durante 10 min. Las constantes cinéticas Km y Vmáx para la putrescina y la cadaverina fueron: 94 µM y 2.3 µmol/min·mg y 75 µM y 0.15 µmol/min·mg, respectivamente. La actividad de la enzima disminuyó en presencia de los compuestos EDC, rasagilina, pargilina y con el deprenil y la semicarbazida a la máxima concentración ensayada. Las principales diferencias entre las lacasas de bacterias lácticas y la putrescina oxidasa de K. varians se hallaron en los sustratos susceptibles de ser degradados y en que la PuO tiene un pH óptimo de actuación neutro o ligeramente alcalino típico de las enzimas amino oxidasas, y una estabilidad térmica mucho más baja. Los logros más importantes derivados de este trabajo son: Es la primera vez que se ha descrito la degradación de aminas en vino por parte de las bacterias lácticas de las especies: Lactobacillus farciminis, Lactobacillus plantarum y Pediococcus acidilactici, así como de la cepa Kocuria varians LTH 1540 de origen alimentario. Es el primer trabajo donde se ha demostrado que las enzimas multicobre oxidasa (EC 1.10.3.2) son capaces de degradar las AB. Es la primera vez que se han identificado las enzimas responsables de la degradación de histamina, tiramina y putrescina en las especies L. plantarum y P. acidilactici. Se ha identificado una putrescina oxidasa en la especie K. varians que no se había descrito previamente. Es la primera vez que se ha descrito que la enzima lacasa del hongo filamentoso T. versicolor es capaz de degradar tiramina, histamina y putrescina en tampón, y las dos primeras también en vino.