Biotechnological production of antifungal proteins for crop protection

Resumen

Los hongos patógenos de plantas causan importantes pérdidas en las cosechas, poniendo en peligro la seguridad y calidad alimentaria. Los péptidos antimicrobianos (AMPs) muestran una actividad lítica potente y duradera específicamente frente a microorganismos, por lo que tienen un gran potencial como nuevos fungicidas naturales para el control de los hongos patógenos. Su explotación requiere de sistemas de producción rápidos, eficaces, económicos y seguros. El principal objetivo de este trabajo era desarrollar sistemas de producción sostenibles de AMPs, y su caracterización en el control de infecciones fúngicas para avanzar en su aplicación en la agricultura. Las proteínas antifúngicas (AFPs) secretadas por hongos filamentosos son un grupo de AMPs ricos en cisteínas, muy estables, activos específicamente frente a hongos. En este estudio demostramos que las plantas de Nicotiana bentamiana son una excelente biofactoría de AFPs mediante expresión transitoria usando un nuevo vector derivado del virus de mosaico del tabaco. Utilizando este sistema de producción en plantas, hemos producido eficientemente dos AFPs muy activas frente a hongos fitopatógenos, la AfpA de Penicillium expansum y la AfpB de Penicillium digitatum. Hemos descubierto que el compartimento subcelular donde se acumulan las AFPs tiene un impacto importante en la producción obtenida, probablemente porque su compartimentalización evita la toxicidad hacia las células vegetales. Los valores más altos se obtuvieron cuando las proteínas se acumularon en las vacuolas, alcanzando hasta 0,170 mg/g de hoja en el caso de la proteína más activa AfpA y hasta ocho veces más para la AfpB (1,2 mg/g de hoja). También demostramos que los extractos crudos de plantas que contienen AFP son activos frente a hongos, sin necesidad de purificar las proteínas reduciendo considerablemente el procesamiento del material vegetal y los costes de producción. Por lo tanto, el sistema desarrollado es eficiente para la producción de AFPs, y también es económico y seguro ya que se basa en plantas. Además, hemos desarrollado un sistema alternativo para la producción del péptido antifúngico PAF102 que previament no había podido producirse biotecnológicamente. Este sistema se basa en acumular el péptido en las gotas lipídicas (LDs) mediante la fusión a una proteína oleosina de plantas. Mediante esta estrategia, hemos producido PAF102 en semillas de arroz en cantidades de 20 mg por gramo de semilla. Sin embargo, la producción en semillas es lenta y para acelerar el proceso hemos transferido la tecnología de la fusión a oleosinas de plantas al sistema de Pichia pastoris. Usando este nuevo sistema hemos obtenido rendimientos comercialmente relevantes con producciones de 180 mg/l de cultivo en sólo 4 días. La acumulación de PAF102 en las LDs de las semillas de arroz y de la levadura facilita enormemente su extracción por simple flotación en soluciones densas, permitiendo la recuperación de péptido activo frente a hongos patógenos. Finalmente, hemos demostrado que tanto AfpA y AfpB producidas en plantas, como los extractos de plantas enriquecidos estas proteinas, son eficaces en la prevención de infecciones fúngicas en cultivos económicamente relevantes, tales como la podredumbre gris causada por Botrytis cinerea en hojas y frutos de tomate, el quemado del arroz causado por Magnaporthe oryzae, o las infecciones de las semillas de arroz por Fusarium proliferatum. Nuestros resultados proporcionan un sistema de producción sostenible de AFPs y demuestran su eficacia en la protección de las plantas contra las infecciones fúngicas, apoyando firmemente su uso como "fungicidas verdes" eficaces y respetuosos con el medio ambiente en la protección de cultivos y postcosecha.