Biotechnological production of antifungal proteins for crop protection

Resum

Els fongs patògens de plantes causen importants pèrdues en les collites, posant en perill la seguretat i qualitat alimentària. Els pèptids antimicrobians (AMPs) mostren una activitat lítica potent i duradora específicament enfront de microorganismes, de manera que tenen un gran potencial com a nous fungicides naturals per al control dels fongs patògens. La seva explotació requereix de sistemes de producció ràpids, eficaços, econòmics i segurs. El principal objectiu d’aquest treball era desenvolupar sistemes de producció sostenibles de AMPs, i la seva caracterització en el control d’infeccions fúngiques per avançar en la seva aplicació en l’agricultura. Les proteïnes antifúngiques (AFPs) secretades per fongs filamentosos són un grup de AMPs rics en cisteïnes, molt estables, actius específicament enfront de fongs. En aquest estudi vam demostrar que les plantes de Nicotiana bentamiana són una excel·lent biofactoria de AFPs mitjançant expressió transitòria usant un nou vector derivat del virus de mosaic del tabac. Utilitzant aquest sistema de producció en plantes, hem produït eficientment dues AFPs molt actives enfront de fongs fitopatògens, la AfpA de Penicillium expansum i la AfpB de Penicillium digitatum. Hem descobert que el compartiment subcel·lular on s’acumulen les AFPs té un impacte important en la producció obtinguda, probablement perquè la seva compartimentació evita la toxicitat cap a les cèl·lules vegetals. Els valors més alts es van obtenir quan les proteïnes es van acumular en els vacúols, aconseguint fins 0,170 mg / g de fulla en el cas de la proteïna més activa AfpA i fins a vuit vegades més per a la AfpB (1,2 mg / g de fulla). També vam demostrar que els extractes crus de plantes que contenen AFP són actius enfront a fongs, sense necessitat de purificar les proteïnes reduint considerablement el processament del material vegetal i els costos de producció. Per tant, el sistema desenvolupat és eficient per a la producció de AFPs, i també és econòmic i segur ja que es basa en plantes. A més, hem desenvolupat un sistema alternatiu per a la producció del pèptid antifúngic PAF102 que prèviament no s’havia pogut produir biotecnològicament. Aquest sistema es basa en acumular el pèptid en les gotes lipídiques (LDs) mitjançant la fusió a una proteïna oleosina de plantes. Mitjançant aquesta estratègia, hem produït PAF102 en llavors d’arròs en quantitats de 20 mg per gram de llavor. No obstant això, la producció en llavors és lenta i per accelerar el procés hem transferit la tecnologia de la fusió a oleosinas de plantes al sistema de Pichia pastoris. Usant aquest nou sistema hem obtingut rendiments comercialment rellevants amb produccions de 180 mg / l de cultiu en només 4 dies. L’acumulació de PAF102 a les LDs de les llavors d’arròs i del llevat facilita enormement la seva extracció per simple flotació en solucions denses, permetent la recuperació de pèptid biològicament actiu. Finalment, hem demostrat que tant AfpA i AfpB produïdes en plantes, com els extractes de plantes enriquits en aquestes proteines, són eficaços en la prevenció d’infeccions fúngiques en cultius econòmicament rellevants, com ara la podridura grisa causada per Botrytis cinerea en fulles i fruits de tomàquet, la piriculariosis causada per Magnaporthe oryzae, o les infeccions de les llavors d’arròs per Fusarium proliferatum. Els nostres resultats proporcionen un sistema de producció sostenible de AFPs i demostren la seva eficàcia en la protecció de les plantes contra les infeccions fúngiques, donant ferm suport per al seu ús com a “fungicides verds” eficaços i respectuosos amb el medi ambient en la protecció de cultius, mentres són al canmp o durant el periode postcollita.