I. Relación entre la actividad trehalasa y la sensibilidad antifúngica en Candida parapsilosis ; II. Análisis bioinformático del metabolismo de la trehalosa en el género Candida

Abstract

I. En las últimas décadas la morbilidad y mortalidad causadas por micosis infecciosas han aumento dramáticamente, siendo la incidencia particularmente grave entre la población inmunodebilitada. La misma incluye neonatos, ancianos, pacientes afectados de SIDA, los enfermos crónicos o los sometidos a hospitalización prolongada o cirugía invasiva. Además, la disponibilidad limitada de compuestos con actividad fungicida y su baja toxicidad selectiva (polienos, azoles o equinocandinas), complica sobremanera la quimioterapia antifúngica. El metabolismo central desempeña una función esencial en hongos patógenos, utilizándose para diseñar nuevos antifúngicos, más potentes y seguros. La presente Memoria ha investigado la susceptibilidad del mutante atc1Δ/ntc1Δ de Candia parapsilosis carente de actividad trehalasa frente a dos azoles: Fluconazol e Itraconazol. La exposición con Itraconazol, pero no con Fluconazol indujo un incremento importante de mortalidad celular en la cepa mutante respecto a la parental. La citometría de flujo reveló que el Itraconazol incrementaba tanto la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) como el potencial mitocondrial. Igualmente, solo el Itraconazol provocó una síntesis significativa de trehalosa endógena. Además, la capacidad de las células mutantes para generar biofilms operativos fue potenciada por la presencia de ambos azoles. Nuestros resultados sobre el hongo oportunista Candia parapsilosis confirman el interés de la trehalosa como diana terapéutica de uso clínico. II. El análisis bioinformático de “cronómetros moleculares” es una herramienta útil para establecer relaciones filogenéticas consistentes entre especies, sirviendo para la clasificación actual de los tres Dominios de la vida. En esta Tesis, se analiza la filogenia de las especies patogénicas más representativas del género Candida, a partir de la comparación de secuencias de aminoácidos correspondientes a las enzimas involucradas en el metabolismo de la trehalosa. Las proteínas con actividad trehalasa neutra (Nth1p/Ntc1p) comparten la presencia de un dominio de unión a calcio, mientras las regiones central y C-terminal de la proteína se correlacionan con el dominio catalítico de la familia 37 de las glicosil hidrosilasas. Con respecto al producto del gen NTC1, el alineamiento máximo ocurre entre las especies C. albicans y C. dubliniensis, con un 92% de aminoácidos idénticos. A su vez, el alineamiento de las secuencias correspondientes a las trehalasas ácidas (genes ATC1/ATH1) revela un grado máximo de homología entre C. albicans y C. parapsilosis. La coincidencia también es muy alta entre C. albicans y C. dubliniensis. C. auris es la levadura patógena que más se diferencia del resto de las analizadas. La superposición de estructuras tridimensionales correspondientes a las dos actividades trehalasa, neutra y ácida, en C. albicans y S. cerevisiae, revela la presencia de dos residuos (Asp y Glu) altamente conservados, ocupando posiciones equivalentes en la molécula que explicarían un idéntico mecanismo de acción catalítica para todas las trehalasas. En todas las especies de Candida, una proteína es responsable de las actividades trehalosa sintasa (Tps1p) y trehalosa fosfatasa (Tps2p). El análisis estructural de Tps1p en C. albicans, revela un plegamiento tipo GT-B, caracterizado por dos dominios plegados Rossmann. El próximo a la región N-terminal contiene un núcleo de seis hojas β paralelas flanqueadas por ocho hélices α. En cambio, el dominio C-terminal adopta una disposición tridimensional β/α/β con seis hojas β paralelas flanqueadas también por ocho hélices α. Tomando como referencia el gen TPS1 (trehalosa sintasa), se concluye una alta homología entre C. albicans y C. dubliniensis (99%), siendo ligeramente inferior con C. tropicalis y C. maltosa (95%). En cambio, C. parapsilosis y C. albicans comparten un 87% de aminoácidos idénticos, siendo la coincidencia entre ambas y C. auris del 83%.