Validación funcional de extractos polifenólicos de cacao mediante ensayos in vivo con organismos modelo

Resum

Los polifenoles son los principales antioxidantes de la dieta y a ellos se les atribuyen múltiples propiedades beneficiosas, como la prevención de enfermedades cardiovasculares, tumorales y degenerativas, que pueden aparecer como consecuencia del estrés oxidativo. El cacao representa una fuente interesante de polifenoles en la dieta, dado su amplio consumo y su riqueza en estos compuestos bioactivos. La actividad antioxidante de los polifenoles en general, y en concreto de los polifenoles del cacao, ha sido ampliamente evaluada in vitro. Sin embargo, los ensayos in vitro no tienen en cuenta aspectos fundamentales en organismos vivos como son la biodisponibilidad y metabolismo, ni proporcionan información sobre los mecanismos in vivo de la respuesta celular antioxidante. Esta tesis doctoral aborda el estudio de la capacidad antioxidante de los polifenoles del cacao in vivo mediante el uso de la levadura Saccharomyces cerevisiae y del nematodo Caenorhabditis elegans como organismos modelo. Para ello, se ha empleado un extracto polifenólico obtenido a partir de un polvo de cacao rico en polifenoles y diversas fracciones cromatográficas obtenidas a partir de dicho extracto, con el fin de identificar los compuestos responsables de los efectos antioxidantes del cacao. Tras la evaluación previa de 26 fracciones correspondientes al extracto completo de cacao, se seleccionaron 7 para su estudio en base a su capacidad protectora antioxidante, las fracciones correspondientes a los compuestos mayoritarios del cacao (teobromina, cafeína, catequina, epicatequina y procianidina B2) y otras dos fracciones que no presentaban ningún compuesto mayoritario. Para el empleo de S. cerevisiae, se ha puesto a punto un método en placa multipocillo que permite estudiar de forma rápida y reproducible la capacidad promotora de respuesta celular antioxidante de ingredientes alimentarios. Se ha demostrado la capacidad protectora antioxidante del extracto de cacao y se han identificado las fracciones más activas, siendo aquellas ricas en catequina, epicatequina y procianidina B2. Por otra parte, se ha utilizado el mutante de deleción hst3Δ, confirmándose la implicación de la sirtuina Hst3 en el efecto antioxidante de S. cerevisiae mediado por los extractos de cacao y de uva y comprobándose una mayor resistencia del mutante al estrés provocado con H2O2 y menadiona. Asimismo, se han llevado a cabo estudios proteómicos y transcriptómicos en la levadura tras haber sido preincubada con el extracto polifenólico de cacao y posteriormente sometida a estrés oxidativo con peróxido de hidrógeno. Los resultados obtenidos han permitido identificar posibles proteínas y genes implicados en la respuesta a dicho estrés mediada por los polifenoles del cacao. En estas condiciones, se ha observado que el metabolismo de carbohidratos se modifica mediante la represión de la glicolisis y el aumento de la ruta de las pentosas fosfato con el fin de obtener poder reductor para hacer frente al estrés oxidativo. Además, se ha observado la represión de algunos genes implicados en la síntesis de proteínas, mientras que algunos de los enzimas secuestradores de radicales libres fueron rápidamente inducidos por el extracto de cacao, como las catalasas y peroxidasas. Mediante el uso de C. elegans, se ha evaluado la capacidad promotora de respuesta antioxidante tanto del extracto polifenólico completo como de fracciones aisladas, mediante ensayos de estrés oxidativo, estrés térmico y formación de especies reactivas de oxígeno (ROS). Se ha confirmado el efecto protector antioxidante, observado en la levadura, del extracto de cacao y de las fracciones ricas en catequina, epicatequina y procianidina B2 en los ensayos de estrés con peróxido de hidrógeno. Por el contrario, sólo el extracto de cacao ofreció protección antioxidante en el nematodo cuando se llevaron a cabo los ensayos de estrés con Na-arsenito, estrés térmico y formación de ROS. Asimismo, se ha establecido la implicación del factor de trascripción DAF-16 en la protección antioxidante del cacao, efecto que además parece estar mediado por el contenido total de polifenoles del cacao y no como resultado de compuestos aislados.