Identificación de genes implicados en la producción de ocratoxina a en aspergillus carbonarius

Resumen

1. INTRODUCCIÓN: Las ocratoxina A (OTA) es una micotoxina que presenta efectos nefrotóxicos, teratogénicos, inmunodepresores y carcinogénicos. Está producida por algunas especies de hongos de los géneros Aspergillus y Penicillium que crecen de manera natural en un gran número de productos agrícolas, como es el caso de los cereales, café, especias, frutos secos, aceitunas, uva, higos, cacao y sus derivados. Después de los cereales, la uva y el vino son la segunda fuente de ingesta de OTA. Las especies de Aspergillus que pertenecen a la sección Nigri, en particular A. carbonarius y las especies que pertenecen al agregado de Aspergillus niger se han identificado como los principales fuentes de contaminación de OTA en vino. El hecho de que se aíslen de la uva un mayor número de cepas ocratoxigénicas de la especie A. carbonarius y que además éstas presenten unos niveles de producción de OTA más elevados, hace que se considere a A. carbonarius como el mayor responsable de la contaminación de OTA en uva y sus derivados. Las moléculas de ocratoxina son pentaquétidos consistentes en una dihidroisocumarina unida por el grupo carboxilo a una molécula de L-ß-fenilalanina mediante un enlace amida. Basándose en la estructura molecular de la OTA está claro que serán necesarios un número importante de reacciones enzimáticas para su biosíntesis. Éstas incluirían una poliquétido sintetasa (PKS) para la síntesis del poliquétido dihidroisocumarina, una ciclasa, una cloroperoxidasa, una estarasa y una péptido sintasa para la ligación de la fenilalanina con la dihidroisocumarina. Sin embargo, se conoce muy poco sobre la ruta de biosíntesis de producción de OTA así como de los genes implicados. Diversos grupos de investigación han descrito genes de PKS involucrados en la producción de OTA en Aspergillus ochraceus, Penicillium nordicum, Aspergillus westerdijkiae y A. carbonarius. Además, se han señalado otros genes que podrían estar implicados en la biosíntesis de OTA como puede ser dos P450 monoxigenasas en A. ochraceus, una péptido sintetasa no ribosomal, junto con dos genes que codifican para una proteína de transporte y una cloroperoxidasa en P. nordicum. Además de generar conocimientos básicos, los genes implicados en la síntesis de OTA podrían servir como dianas para el diseño de cebadores específicos que permitan discriminar los hongos productores de los no productores, así como aportar información para el diseño de posibles métodos de control. 2. OBJETIVOS: El objetivo general de esta tesis doctoral ha sido la identificación de genes implicados, directa o indirectamente, en la producción de OTA. Para abordar este objetivo general se propusieron los objetivos concretos que se detallan a continuación: 1.- Construcción de una genoteca normalizada y sustraída enriquecida en genes de A. carbonarius que se inducen en condiciones de producción de OTA. 2.- Análisis del proteoma de dos cepas de A. carbonarius antagónicas en su habilidad para producir OTA. 3.- Obtención y caracterización de un mutante fluorescente de A. carbonarius. 4.- Obtención de mutantes de deleción de A. carbonarius de genes inducidos en condiciones de producción de OTA. 5.- Estudio del efecto del estrés oxidativo sobre la producción de OTA en A. carbonarius 3. MATERIAL Y MÉTODOS: Como modelo de estudio se eligieron dos cepas de A. carbonarius, W04-40 y W04-46, productora y no productora de OTA respectivamente. Como análisis previo se realizó un estudio cinético de producción de OTA a lo largo del tiempo para optimizar las condiciones de partida para la construcción de la genoteca y el análisis del proteoma. Para llevar a cabo la construcción de la genoteca normalizada y substraída de cDNA se utilizó la técnica denominada Hibridación Substractiva Supresiva (HSS). La HSS permite obtener clones de genes que se están expresando de manera diferencial en dos poblaciones. Ésta técnica se realizó mediante el ¿kit¿ comercial ¿PCR-Select cDNA subtraction kit¿ (Clontech). Para el análisis del proteoma se realizó extracción total de proteínas intracelulares que se separaron mediante electroforesis bidimensional. Posteriormente, se analizó la expresión diferencial de los posibles genes implicados en la producción de OTA mediante PCR a tiempo real (RT-PCR). Aquellos genes que presentaron interés, se secuenciaron mediante la técnica conocida como paseo cromosómico utilizando el ¿kit¿ GenomeWalkerTM Universal (Clontech). Para confirmar su implicación en la biosíntesis de OTA se obtuvieron mutantes de deleción mediante la transformación con Agrobacterium tumefaciens. 4. RESULTADOS: Tras llevar a cabo la cinética de producción de OTA se eligió el día 2 de crecimiento en medio CYA como tiempo óptimo para realizar las extracciones de RNA, la HSS y la extracción de proteínas. La cepa de A. carbonarius (W04-46) presentó valores de producción de OTA despreciables a lo largo de los 5 días de crecimiento Después de analizar la genoteca substraída se identificaron un total de 109 secuencias mediante BlastX con valores de similitud significantes (Evalue < 10-5) a secuencias depositadas en la base de datos del NCBI de proteínas no redundantes. Dichas secuencias se podrían corresponder con genes que se están expresando diferencialmente en condiciones de producción de OTA. De estas 109 ESTs, 26% estaban implicadas en procesos de regulación, 15% correspondían a proteínas hipotéticas, 12% estaban implicadas en respuesta a estrés y detoxificación, 9% correspondían a procesos de transporte y secreción, 7% correspondían al metabolismo de los aminoácidos, 7% estaban implicados en la hidrólisis de reservas de energía y 5 % en el metabolismo secundario. Otras unisecuencias mostraron homología con genes implicados en la síntesis de proteínas y le metabolismo general. Atendiendo a la similitud de estas secuencias con genes de la base de datos del NCBI se discuten sus posibles implicaciones funcionales en la producción y regulación de OTA. Entre los genes identificados es interesante mencionar la presencia de importantes factores transcripcionales como por ejemplo dedos de zinc, un regulador de AreA y un factor de transcripción bZIP. También es interesante señalar el alto porcentaje de genes encontrados relacionados con respuesta a estrés oxidativo y procesos de detoxificación. Los proteomas se comprararon utilizando el programa PDQuest, y se encontraron 21 proteínas que presentaban diferencias estadísticamente significativas entre la cepa productora (W04-40) y la no productora (W04-46). Dentro de estas proteínas, 9 se pudieron identificar mediante MALDI-MS(/MS) correspondiéndose a 7 proteínas con mayor expresión en la cepa productora (W04-40) y 2 en la cepa no productora (W04-46). Algunas de las proteínas identificadas presentaron homología con proteínas implicadas en procesos de regulación, metabolismo de aminoácidos, estrés oxidativo y esporulación. Es interesante mencionar una proteína con homología a la proteína CipC ya que presentó una expresión 126.5 veces mayor en la cepa W04-40. Las variaciones de expresión de los genes diferenciales identificados mediante la HSS y el análisis de proteomas fueron comprobados a nivel de RNAm por PCR a tiempo real (RT-PCR) no encontrando siempre una correlación directa. De entre los genes analizados y comprobados positivamente se seleccionaron dos, un transportador de la familia MFS, flu1 (identificado por la HSS) y una proteína de función desconocida CipC (identificado por proteómica). Se secuenciaron mediante la técnica de paseo cromosómico y se obtuvieron mutantes de deleción. Se observó un incremento de la producción de OTA en todos los mutantes obtenidos en este trabajo que podría ser debido a un efecto pleiotrópico del proceso de transformación del hongo. Sin embargo, el incremento de OTA fue mayor en los mutantes de deleción de los genes flu1 y cipC. Estos datos sugieren que en ausencia de dichos genes aumenta la producción de OTA. La caracterización de los genes flu1 y cipC basada en el estudio de los dominios proteicos, los análogos estructurales de las proteínas y el fenotipo resultante de los mutantes de deleción de dichos genes, indicó que flu1 y cipC podrían estar implicados en la respuesta a estrés y/o detoxificación. Además, se obtuvo un transformante de A. carbonarius marcado con la proteína fluorescente eGFP que constituye una herramienta útil para monitorizar los procesos de infección del hongo en uvas. En cuanto al estudio del efecto del estrés oxidativo sobre la producción de OTA en A. carbonarius se observó que la cepa productora de OTA es más sensible al estrés oxidativo que la cepa no productora al adicionar de peróxido de hidrógeno. Asimismo, el cultivo de A. carbonarius en presencia de sustancias oxidantes tuvo como consecuencia una mayor generación de ROS y un incremento en la producción de OTA. Estos datos demuestran una estrecha relación entre estrés oxidativo y producción de OTA en A. carbonarius. Por último, los resultados obtenidos en los ensayos de cultivo de A. carbonarius en presencia de sustancias antioxidantes indicaron que no existe una relación clara y directa entre la aplicación de sustancias antioxidantes y disminución de la biosíntesis de OTA para las concentraciones ensayadas en este trabajo. Este estudio además de generar conocimientos básicos sobre la síntesis de OTA por A. carbonarius, puede contribuir al desarrollo de métodos de detección y cuantificación específicos requeridos para el control de contaminación por OTA en la industria de la uva y el vino.