Desarrollo de métodos inmunoquímicos para el análisis en alimentos de fungicidas inhibidores de la succinato deshidrogenasa

Resumen

El uso de plaguicidas constituye una forma eficaz y hoy por hoy necesaria para combatir gran parte de las plagas que afectan a los cultivos agrícolas. Sin embargo, su uso puede dar lugar a la aparición de residuos en los alimentos que llegan al consumidor, lo que puede derivar en un problema de seguridad alimentaria. Por ello, es necesario el desarrollo de métodos analíticos altamente sensibles y selectivos para la monitorización de dichos residuos, que permitan la detección de concentraciones lo más bajas posibles. En este contexto, en esta Tesis Doctoral se ha abordado el desarrollo de métodos inmunoquímicos de elevada sensibilidad y selectividad para el análisis en muestras de alimentos de trazas de fluopyram y penthiopyrad, dos novedosos fungicidas del grupo de inhibidores de la succinato deshidrogenasa (SDHI). Estos métodos hacen uso de anticuerpos específicos para detectar los analitos de interés. Dada la versatilidad, fiabilidad, bajo coste y sencillez de este tipo de técnicas, entre otras propiedades, los inmunoensayos desarrollados podrían constituir así métodos alternativos y complementarios a los métodos cromatográficos convencionales para determinadas aplicaciones, como son las situaciones de crisis y alarma alimentaria o la monitorización de una sustancia concreta en un elevado conjunto de muestras. Para lograr este propósito, se siguió un esquema bien establecido, fruto de varias décadas de investigación con moléculas pequeñas similares a los dos fungicidas de estudio. En primer lugar, mediante síntesis orgánica total se prepararon cuatro análogos funcionalizados (haptenos) de fluopyram (FPa, FPb, FPha’ y FPhb), cada uno de los cuales incorporaba en posiciones opuestas un brazo espaciador equivalente terminado en un grupo carboxilato, que más tarde se emplearía para enlazarlos covalentemente a proteínas transportadoras. Del mismo modo, para el fungicida penthiopyrad se obtuvo un total de cinco haptenos (PPa, PPb, PPm, PPd’ y PPo). Todos los haptenos sintetizados fueron después enlazados covalentemente mediante el método del éster activo a diversas proteínas transportadoras (BSA, OVA y HRP) para dar lugar a un conjunto de conjugados proteína–hapteno. Algunos de ellos fueron después inoculados en animales de laboratorio, lo que dio lugar a una colección de anticuerpos policlonales de conejo y monoclonales de ratón específicos para fluopyram y penthiopyrad. Los anticuerpos generados fueron caracterizados mediante ELISA competitivo en dos formatos para determinar su afinidad y especificidad frente a fluopyram y penthiopyrad, así como para encontrar las condiciones más adecuadas para el desarrollo de los inmunoensayos deseados. En el caso de fluopyram, se encontró que los dos inmunógenos inoculados, basados en los haptenos FPa y FPb, presentaron una capacidad similar para generar anticuerpos de elevada afinidad hacia el fungicida, lo que podría deberse a la adquisición de una conformación plegada similar por parte de ambos y por tanto la exposición de elementos equivalentes durante la respuesta inmunitaria. En cuanto a penthiopyrad, el mejor inmunógeno resultó ser el basado en el hapteno PPm, que presentaba una gran similitud con el analito al aprovechar su fragmento alifático ramificado característico como brazo espaciador; de hecho, el reconocimiento molecular mostró gran dependencia con las variaciones estereoelectrónicas inducidas por el brazo espaciador. En general, con los anticuerpos generados se pudieron llevar a cabo inmunoensayos capaces de detectar hasta 24 pg/g de fluopyram y 33 pg/g de penthiopyrad. En paralelo a la caracterización de los anticuerpos policlonales y monoclonales, se llevó a cabo un estudio de la respuesta inmunitaria hacia moléculas pequeñas haciendo uso de inmunógenos basados en nanotubos de carbono, a los que se unió covalentemente el conjugado BSA–PPm o bien el hapteno PPm. Los dos complejos fueron inoculados en conejos de laboratorio siguiendo distintas pautas y acompañados o no de adyuvante de Freund, y se monitorizó mediante ELISA competitivo la evolución del título y de la afinidad de los anticuerpos generados. El resultado permitió concluir que es posible desencadenar el proceso de maduración de la respuesta inmunitaria (respuesta inmunitaria secundaria) hacia el hapteno PPm sin mediación proteica y con dosis tan bajas como 0.1 μg de hapteno, siempre y cuando en la respuesta inmunitaria primaria (primer contacto con el inmunógeno) sí exista participación de proteína transportadora y se incluya adyuvante de Freund en todo el proceso. Además, se comprobó que los inmunógenos basados en nanotubos de carbono presentan carácter autoadyuvante cuando contienen proteína transportadora. Con toda la información recabada, se seleccionaron cuatro inmunoensayos de tipo ELISA competitivo, dos por cada analito, y se evaluó la influencia de las variables fisicoquímicas más importantes del ensayo (pH y fuerza iónica) en sus parámetros, así como la tolerancia a algunos disolventes orgánicos (metanol, etanol y acetonitrilo), observándose una gran robustez por parte de todos ellos. Tras esta caracterización, los ensayos se dieron por desarrollados y se procedió a su aplicación a muestras fortificadas y tratadas en campo de ciruela y uva, así como a muestras de mosto y vino derivadas de las de uva. Las frutas se analizaron en forma de extractos orgánicos obtenidos mediante el procedimiento denominado QuEChERS (método oficial de la EFSA para la extracción de plaguicidas de muestras vegetales), mientras que los mostos y vinos se analizaron de forma directa. Con los métodos inmunoquímicos desarrollados fue posible la cuantificación de hasta 5 ng/mL de ambos fungicidas en extractos de frutas y de 10 ng/mL en mostos y vinos. Estos excelentes límites analíticos resultaron ser muy inferiores a los límites máximos de residuo (LMR) establecidos para dichas frutas en la Unión Europea, con lo que se dio por logrado el objetivo principal de la Tesis Doctoral. Finalmente, y como un estudio adicional para demostrar su aplicabilidad real, los inmunoensayos desarrollados se aplicaron a la evaluación de la transferencia de fluopyram y penthiopyrad de la uva al vino, concluyéndose que el primero se transfiere completamente y que el segundo lo hace aproximadamente en un 50%.