Desarrollo de nuevos sistemas separativos para la determinación de biomoléculas en matrices vegetales

Resumen

La presente memoria se enmarca dentro de las líneas de investigación del grupo de investigación, entre las que se encuentran: i) el desarrollo de materiales poliméricos con fines separativos, y ii) la puesta a punto de metodologías analíticas rápidas y fiables para el control de calidad en la industria de aceites vegetales y otros productos de interés agroalimentario. En consecuencia, los objetivos principales de esta Tesis Doctoral son: i) el diseño y optimización de soportes poliméricos modificados con nanopartículas metálicas (tales como el oro y la plata) para la extracción de proteínas en matrices vegetales, ii) la preparación y evaluación de sistemas de extracción de proteínas en dichas muestras asistida por enzimas y iii) el desarrollo de metodologías analíticas de separación rápidas y fiables con el fin de poder establecer el origen genético y botánico de diversos productos alimentarios. La presente memoria de Tesis Doctoral se divide en cuatro grandes bloques. El primer bloque consta de una introducción, donde se describen brevemente las muestras vegetales empleadas en esta Tesis Doctoral (fruto, hoja y aceite de olivo, frutos de la variedad Citrus (en concreto naranjas y mandarinas) y muérdago, correspondientes a los Capítulos 1-3, respectivamente). Además, se incluye una revisión actualizada de los métodos de extracción empleados durante la tesis: extracción en fase sólida (SPE), extracción asistida por enzimas y por último, el empleo de las bibliotecas combinatorias de ligandos peptídicos (CPLLs). El bloque de introducción concluye con una breve descripción de las técnicas analíticas empleadas en el desarrollo de la Tesis Doctoral (Capítulo 5). El segundo bloque (que engloba los capítulos 6-11) está dedicado al desarrollo de nuevas técnicas de extracción de proteínas en matrices de origen vegetal. Para ello, se han puesto a punto nuevos sorbentes, basados en materiales poliméricos sintetizados a partir del metacrilato de glicidilo (GMA), que son posteriormente modificados con nanopartículas metálicas (de oro y plata) para su uso como sorbentes en SPE. Por otro lado, la presencia de sistemas reticulares u organizados, presentes en los vegetales, requiere habitualmente de tratamientos relativamente “agresivos” con el fin de poder extraer los analitos diana. En este sentido, se han llevado a cabo estudios de extracción de proteínas asistidos por enzimas, empleándose tanto enzimas individuales como mezclas de las mismas. Gracias a la acción de estas biomacromoléculas, se facilita la ruptura de las membranas celulares, y por ende la extracción de los analitos para su posterior análisis y cuantificación. Estos pretratamientos de la muestra, sin duda, permitirán obtener resultados de mayor calidad. En este caso, se ha empleado dicha tecnología para la extracción de proteínas de diversos productos del olivo (hojas, huesos y pulpa), así como para muestras de naranja y mandarina, incluyendo tanto la piel como la pulpa de las mismas. Por último, se ha llevado a cabo un estudio del proteoma del muérdago mediante la extracción del mismo empleando las CPLLs, que son capaces de extraer y preconcentrar las proteínas de baja abundancia. La identificación del mapa proteico de esta planta ha permitido profundizar en un mayor conocimiento de sus propiedades medicinales. El tercer bloque (que engloba los capítulos 12-20) muestra el desarrollo de una amplia variedad de métodos de análisis para la determinación de diferentes compuestos en matrices de origen vegetal, tales como aceite de oliva, frutos y hojas de olivo, frutos de la variedad Citrus (naranjas y mandarinas), y muérdago). Dichas metodologías abarcan tanto técnicas de carácter cromatográfico (HPLC) y afines (CZE, CGE y CEC) así como de carácter espectrométrico (ATR-FTIR o DIMS). Se han desarrollado metodologías analíticas para la determinación de proteínas, TAGs, esteroles, ácidos grasos y péptidos. Además, en muchos de los capítulos, se han aplicado herramientas quimiométricas de análisis, en concreto, se han construido modelos de análisis discriminante lineal (LDA), para establecer la clasificación de muestras de aceites vegetales en función de su origen botánica, para la discriminación de productos del olivo, incluyendo aceites de oliva, en función de su variedad genética y en caso de los aceites de oliva, también para clasificarlos en función de su índice de madurez. En algunos de ellos, se ha aplicado la regresión lineal múltiple (MLR) para cuantificar mezclas binarias de diferentes variedades genéticas