Aproximación metabolómica a los zumos de fruta mediante la cromatografía de líquidos y de gases acoplada a la espectrometría de masas

Zusammenfassung

Durante los últimos años, tanto consumidores como diferentes sectores comerciales y políticas de mercado se han orientado hacia la consecución de hábitos alimentarios equilibrados desde el punto de vista nutricional. En este sentido, los metabolitos presentes en las frutas y sus derivados ejercen un papel esencial sobre la salud humana y su buena preservación. Este grado de continua sofisticación demanda el desarrollo de nuevos protocolos analíticos que permitan seguir el rastro de un amplio espectro de nutrientes y metabolitos presentes en frutas y sus derivados, de tal forma que sea posible cuantificar y, con ello, minimizar las posibles perdidas que puedan acontecer durante las etapas de postcosecha y procesado industrial. Hay que tener en cuenta que la mayoría de las frutas tienen un perfil metabolómico muy complejo, con una gran número de metabolitos a evaluar, por lo que se requiere el uso de metodologías de análisis de alto rendimiento para su estudio, fundamentalmente cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (GC-MS) y cromatografía líquida de alta resolución acoplada a espectrometría de masas (HPLC-MS). La GC-MS es la metodología analítica elegida tradicionalmente para la separación y determinación (identificación y cuantificación) de volátiles presentes en matrices complejas. Además, para la determinación simultánea de azúcares, ácidos orgánicos y aminoácidos en vegetales, también, se ha empleado el GC-MS, después de la conversión de estos compuestos en sus correspondientes trimetil-silil (TMS) derivados, pero su determinación en los zumos de cítricos es más bien escasa. En esta línea, el empleo de potentes plataformas de cromatografía líquida acoplada a masas (HPLC-MS) está derivando hacia el análisis masivo de metabolitos en detrimento de su tradicional uso orientado únicamente hacia el estudio de compuestos específicos aislados. La alta sensibilidad de los sistemas de MS genera una inmensa cantidad de datos experimentales que necesita ser procesada adecuadamente. Hasta hace poco, este análisis se llevaba a cabo de forma manual o semi-automática mediante el uso de algoritmos matemáticos ofrecidos por los propios fabricantes de las diferentes plataformas de análisis (como XcaliburTM de Thermo Scientific). Estos antiguos algoritmos son, normalmente, bastante caros, tediosos y conlleva mucho tiempo el procesamiento de datos, e incluso podría llegar a ser casi imposible si los espectros adquiridos están contaminados con iones de picos superpuestos, sangrado de columna o de contaminantes de la cámara de ionización. Para superar este problema, la bioinformática nos puede ayudar a llevar a cabo un procesamiento preciso. Idealmente, estos programas de análisis deben ser baratos, fáciles de usar, versátiles, rápidos y capaces de deconvolucionar picos solapados, lo que proporcionará unos resultados fiables cualitativa y cuantitativamente. En este contexto, el National Institute of Standards and Technology-Automated Mass Spectral Deconvolution and Identification System (NIST-AMDIS) es un software de descarga gratuita (http://chemdata.nist.gov/mass-spc/amdis/downloads) para el procesamiento de los datos obtenidos por GC-MS, que incorpora capacidades automáticas de alto rendimiento y funciona con casi cualquier archivo de datos de GC-MS, con independencia de su origen. NIST-AMDIS elimina los sesgados y deconvoluciona los iones del TIC (cromatograma de iones totales), extrae una serie de espectros de masas "limpias" ("components"), así como sus correspondientes tiempos de retención, e identifica los compuestos presentes en la muestra (¿targets¿), haciendo coincidir el espectro de masas de los "componentes" y, opcionalmente, también sus tiempos de retención, frente a una librería de referencia, ya sea comercial, como es el caso de la librería NISTTM, o construida por el propio operador. NIST-AMDIS se ha utilizado para la determinación de marcadores urinarios en trastornos metabólicos, venenos y drogas, de contaminantes en el agua y hortalizas, de los esteroides en la matriz sedimentaria, de los compuestos polares y plaguicidas en hortalizas, y de compuestos volátiles en tomate. Por otro lado, la HPLC es la técnica de separación de sustancias más ampliamente utilizada. Los sistemas HPLC-MS facilitan el análisis de muestras que tradicionalmente han sido difíciles de analizar por GC-MS es decir, analitos poco volátiles. Como resultado, la técnica es ampliamente utilizada en el análisis de compuestos fenólicos. Los sistemas de ionización que han hecho posible este desarrollo son los sistemas API-EI y APCI. De esta forma se pueden analizar compuestos de peso molecular de hasta 100kDa, con un rango de polaridades que va desde analitos no polares hasta los muy polares. Los espectros de masas obtenidos por HPLC-MS suelen ser más sencillos que los obtenidos en GC-MS debido a que el nivel de fragmentación de las moléculas es menor. El inconveniente es que los espectros dependen parcialmente de los parámetros de ionización, es decir, que no pueden ser considerados como ¿huella dactilar¿ del compuesto y, por tanto, la comparación con colecciones de espectros estándares no es posible. Por esta razón, la comparación del espectro de masas de analitos con patrones debe realizarse en las mismas condiciones de trabajo. La continua tecnificación de los sistemas LC-MS y el marketing desmesurado que llevan asociado, hace que en la actualidad amplios sectores de la investigación tengan el falso convencimiento de que para desarrollar una actividad científica competitiva se tenga que recurrir exclusivamente a equipaciones muy complejas y extraordinariamente caras. Además, los distintos fabricantes en su afán por ampliar sus mercados tratan de convencer a los potenciales usuarios con sistemas completamente automáticos que trabajan prácticamente de manera independiente del operador y sus conocimientos. Sin embargo, es deber de los investigadores, sobre todo de aquellos que utilicen recursos públicos, el tener que maximizar los resultados que puedan obtenerse mediante el empleo de los sistemas MS que estén a su disposición. En este sentido, la formación del investigador tanto en su conocimiento de base (background) así como acerca de los equipos de análisis que esté utilizando, es crucial para ejecutar acciones de índole científica de calidad. Estas consideraciones son aún más relevantes si los equipos de análisis empleados son considerados ¿obsoletos¿ frente a los nuevos sistemas de hoy en día. Teniendo en cuenta todo lo anterior, la presente Tesis Doctoral plantea llevar a cabo una aproximación metabolómica de diferentes extractos naturales mediante el empleo de ¿veteranos¿ equipos de espectrometría de masas convencionales como lo son los detectores de tipo trampa iónica, tanto de líquido como de masas, de hace una década. Así pues, este trabajo trata de demostrar como con una formación adecuada al respecto de la materia estudiada así como de los equipos de análisis empleados se pueden llevar a cabo estudios de máxima calidad científica.