Biosíntesis y acumulación de carotenoides en frutos cítricos y su implicación en la calidad postcosecha

Resumen

La conservación refrigerada es una de las tecnologías más utilizadas para preservar la calidad postcosecha de frutas y hortalizas. Los cítricos son el principal frutal que se produce en el mundo y el transporte refrigerado es esencial para conservar la calidad y cumplir con los requisitos de los mercados. Sin embargo, los cítricos presentan una alta sensibilidad a las bajas temperaturas. Los frutos de pomelos se encuentran entre los cítricos más sensibles al frío y desarrollan manchados en la piel conocidos como daño por frío (DF), a temperaturas por debajo de 8-10 ºC. Estas alteraciones no afectan a la calidad interna del fruto, pero deprecian de forma importante su valor comercial. Por ello, es necesario conocer los factores implicados en los DF a fin de identificar posibles estrategias para un control eficiente de esta fisiopatía. Por otro lado, los carotenoides son los pigmentos responsables de la coloración de los frutos cítricos y, por tanto, su contenido y composición determina de forma importante la calidad. Con estos antecedentes, en esta Tesis Doctoral se ha abordado el estudio del papel de los carotenoides (Capítulo I), la influencia del etileno (Capítulo II) y del sistema antioxidante (Capítulo III) en la respuesta de los frutos de pomelo y su sensibilidad al DF durante la conservación refrigerada. Este objetivo se ha complementado con la caracterización de los cambios fisiológicos, moleculares y celulares que ocurren en frutos cítricos en condiciones ambientales de oscuridad (Capítulo IV) y en variedades con diferente pigmentación durante la maduración (Capítulo V). Durante almacenamiento en frío de los frutos de pomelo blanco Marsh (MSH) y pomelo rojo Star Ruby (SR), se observó que la incidencia de DF en la variedad roja SR se limitó exclusivamente a las zonas amarillas de la piel, mientras que las zonas rojas permanecieron completamente intactas. El contenido y composición de carotenoides entre ambas zonas fue muy diferente, con el doble de carotenoides totales y especialmente 14 veces más licopeno en las zonas rojas. Para comprobar la implicación del licopeno en la tolerancia al DF de las zonas rojas, se incrementó el contenido del mismo mediante dos estrategias: inducción química y manipulación ambiental. La aplicación postcosecha de CPTA [2-(4-chlorofeniltio)trietilamina hidrocloruro], un inhibidor de la ciclación del licopeno, a frutos de pomelos MSH incrementó el contenido en carotenoides (x 7) y principalmente de licopeno (x 32) en la piel de los frutos y redujo la susceptibilidad a los DF durante la conservación posterior a 2 ºC. En una segunda aproximación se taparon los frutos de pomelo SR durante la maduración en el árbol, lo cual potenció la coloración roja de la piel, respecto a los expuestos a fotoperiodo normal, y se incrementó la acumulación de carotenoides, principalmente los carotenos fitoeno (x 3) y licopeno (x 75). Los frutos tapados, con un alto contenido en licopeno, fueron más tolerantes a los DF que los no tapados. Se ha investigado la implicación del etileno, tanto de la biosíntesis como de la percepción, en la sensibilidad al DF en los frutos de pomelo. Los frutos de ambas variedades de pomelo manifestaron DF a partir de los 15-20 días de almacenamiento a 2 ºC y la expresión de los genes de biosíntesis de etileno (ACS1, ACS2 y ACO) se estimuló exclusivamente en los frutos sensibles, por lo que estos genes podrían ser buenos marcadores de sensibilidad al frío. La aplicación de 1-MCP, un inhibidor de la acción del etileno, provocó un aumento notable de la producción de la hormona, a través de la estimulación de los genes biosintéticos, corroborando la regulación auto-inhibitoria de la síntesis de etileno en los frutos de pomelo. La expresión de genes correspondientes a receptores de etileno (ETRs) y factores de respuesta (ERFs) se estimularon por las bajas temperaturas de conservación. Dado que la principal función de los carotenoides como antioxidantes radica en la inactivación de especies reactivas del oxígeno, principalmente el oxígeno singlete, se evaluó la implicación del sistema antioxidante en la piel de frutos sensibles y tolerantes al DF. Los frutos tapados, con un mayor contenido de licopeno y tolerantes al DF, presentaron una capacidad para inactivar el oxígeno singlete (SOAC) 2-3 veces superior a la de los frutos sensibles durante todo el período de almacenamiento. La evaluación de los sistemas antioxidantes enzimático (glutatión reductasa, superóxido dismutasa, catalasa, ascorbato peroxidasa) y no enzimático (ácido ascórbico y glutatión), reveló un papel marginal de ambos sistemas en la mayor tolerancia al DF de los frutos tapados. En su conjunto estos resultados sugieren que el licopeno podría ser el responsable de la tolerancia de los frutos de pomelo a los DF, a través de la inactivación del oxígeno singlete, indicando, a su vez, un posible papel de esta especie reactiva en el daño oxidativo por las bajas temperaturas. En la segunda parte de esta tesis se han estudiado las bases fisiológicas y moleculares que promueven la acumulación de licopeno en los frutos de pomelo SR al madurar en ausencia de luz. En los frutos que permanecieron tapados durante el cambio de color se produjo una aceleración de la desverdización natural, un aumento de hasta 50 veces del contenido de licopeno y una notable reducción de xantofilas y ABA, metabolitos de etapas posteriores de la ruta. Estos resultados sugieren que la ausencia de luz provoca un bloqueo en la ruta de biosíntesis a nivel de la ciclación del licopeno. El estudio de la expresión de los genes de la ruta de biosíntesis de carotenoides reveló un efecto estimulador de la luz sobre la transcripción de la mayoría de los genes. En este sentido cabe destacar que los pomelos presentan una menor expresión y actividad de la enzima ?LCY2, clave en la ciclación de licopeno en frutos cítricos, y su menor expresión en frutos tapados acentuaría de forma notable la acumulación de licopeno. Paralelamente, en los frutos tapados la ausencia de luz provocó una aceleración en la transición de cloro- a cromoplastos y un aumento en la expresión de las chaperonas HSP20-4 y HSP21. Estos cambios podrían estar directamente relacionados con la diferenciación de nuevas estructuras a nivel de los plástidos que favorecerían la síntesis y acumulación de carotenoides. La aparición de numerosos cristales de licopeno en frutos tapados, no detectados en los no tapados, sugiere una estrecha relación entre la presencia de determinadas estructuras y los carotenoides que se acumulan. En la última parte de este trabajo se investigó la posible relación entre el perfil de carotenoides en la piel y la pulpa de frutos cítricos con distinta composición, y el tipo de subestructuras que se desarrollan en los plástidos, ya que estos orgánulos constituyen el sito de síntesis y acumulación de carotenoides. La composición en carotenoides parecería determinar la ultraestructura de los plástidos. Los plastoglóbulos y las membranas aclorofílicas fueron las estructuras más abundantes en los cromoplastos de la piel de los frutos de naranjas y pomelos, siendo probablemente lugares activos de síntesis y acumulación de fitoeno y ?,?-xantofilas. La presencia de licopeno se asoció a estructuras cristalinas alargadas, mientras que la inusual y elevada concentración de carotenos incoloros en la pulpa del mutante amarillo Pinalate fue paralela a la presencia exclusiva de un nuevo tipo de subestructuras globulares. Los resultados demuestran que los plástidos de los frutos cítricos presentan una plasticidad extraordinaria, lo que permite una redistribución de los carotenoides en diferentes compartimentos celulares que puede potenciar su acumulación y evitar posibles efectos deletéreos.