Tecnología LAMPavances en el diagnóstico de esquistosomosis y estrongiloidosis

Laburpena

Las Enfermedades Tropicales Olvidadas o Desatendidas (NTDs; del inglés Neglected Tropical Diseases) son un grupo heterogéneo de 20 entidades, de elevada prevalencia principalmente en áreas tropicales y subtropicales, que afectan a más de mil millones de personas pertenecientes a comunidades empobrecidas con consecuencias devastadoras en el ámbito social, económico y de la salud. Geográficamente, las regiones más afectadas por las NTDs son el África subsahariana, el sureste asiático y las regiones tropicales de América. Sin embargo, en los países occidentales, el número de casos importados de algunas de estas NTDs, como la esquistosomosis y la estrongiloidosis, ha ido incrementando en los últimos años debido al aumento del flujo migratorio y los viajes a regiones endémicas de estas enfermedades. En relación a la esquistosomosis, se han registrado ya casos de transmisión autóctona en Europa, incluyendo España, y la aparición de formas híbridas que pueden tener consecuencias en el diagnóstico, transmisión y morbilidad de la enfermedad. La estrongiloidosis importada también ha sufrido un incremento en su diagnóstico en áreas no endémicas, convirtiéndose según los últimos estudios en un reto para la Salud Pública mundial. Por otra parte, hay que destacar que las coinfecciones de estas dos enfermedades son frecuentes debido al solapamiento geográfico de sus áreas de distribución. Los problemas de diagnóstico a los que se enfrentan estas enfermedades, especialmente en zonas endémicas de bajos recursos, son la falta de sensibilidad de las técnicas tradicionales y la incapacidad de aplicación de metodologías con elevada sensibilidad y especificidad como los métodos moleculares, ya que requieren de equipos complejos que tienen un coste elevado. La técnica de amplificación isotérmica de ácidos nucleicos LAMP (del inglés, Loop-mediated isothermal amplification), presenta las ventajas de rapidez, sencillez, especificidad y fácil aplicación en campo, necesarias para ser un método adecuado para el diagnóstico de las NTDs. El LAMP ya ha sido utilizado con éxito para el diagnóstico de esquistosomosis en estudios de campo en áreas de escasos recursos. Sin embargo, aún no se ha utilizado para la posible detección de híbridos. En el caso de la estrongiloidosis, los estudios con la tecnología LAMP son más limitados, y ninguno de ellos ha evaluado su eficacia en el terreno. Las ventajas de desarrollar un método LAMP múltiplex, que permita la detección simultánea de coinfecciones, supondría un gran avance en el diagnóstico de estas enfermedades. Los métodos utilizados para el desarrollo de un LAMP múltiplex son variados, y hasta la fecha no están estandarizados. En este contexto, teniendo en cuenta la reciente aparición e introducción de formas híbridas de esquistosomas en áreas no endémicas, y la elevada prevalencia de coinfecciones en zonas endémicas, nos planteamos como hipótesis de trabajo la necesidad de disponer de un método LAMP múltiplex que permita la detección simultánea de varios patógenos en un mismo ensayo. Todo ello, buscando la posibilidad de su adaptación al diagnóstico point-of-care de las NTDs. Así, nos propusimos como objetivo general la aplicación de la tecnología LAMP y la adaptación a un formato múltiple que permita su uso como diagnóstico point-of-care y la detección simultánea de varios patógenos. Para ello, se definieron diversos objetivos específicos que se van logrando en los diferentes artículos de investigación presentados en esta Tesis Doctoral. El primer objetivo específico se basó en la evaluación de la tecnología LAMP para la detección de formas híbridas de esquistosomas. Para ello, utilizamos un método LAMP para la amplificación género-específica de Schistosoma previamente desarrollado por nuestro grupo de investigación. Se evaluó su eficacia con diferentes perfiles moleculares de híbridos S. haematobium/S. bovis procedentes del primer brote de esquistosomosis urogenital autóctono registrado en Europa (Córcega) y en estudios en Costa de Marfil. En el segundo objetivo específico nos planteamos desarrollar un método LAMP múltiplex con el fin de poder detectar coinfecciones producidas por S. mansoni y Strongyloides spp. Para ello, adaptamos el método SmMIT-LAMP y el método Strong-LAMP, previamente desarrollados por nuestro grupo de investigación, de forma conjunta por primera vez a la metodología DARQ-LAMP como sistema de detección múltiple de las dianas amplificadas. El método empleado en el desarrollo de nuestro LAMP múltiplex es adaptable a otros métodos LAMP en formato dúplex para la detección de otras posibles coinfecciones. Además, evaluamos su funcionalidad con los reactivos estabilizados y almacenados a temperatura ambiente en un formato ¿listo para su uso¿ en un dispositivo portátil de detección a tiempo real, favoreciendo su posible aplicación en estudios de campo. El tercer objetivo específico tuvo como finalidad aplicar la tecnología LAMP para el diagnóstico point-of-care de la estrongiloidosis en una zona endémica de escasos recursos. Para ello, aplicamos nuestro Strong-LAMP en un estudio de campo realizado en Cubal, Angola, en el que se recogieron un total de 192 muestras de heces de pacientes. Se compararon los resultados obtenidos con el análisis parasitológico convencional mediante observación directa con solución salina y técnica de Baermann. Además, para comprobar la reproducibilidad de la técnica, se reanalizaron posteriormente las muestras en un laboratorio de referencia y se compararon los resultados con una qPCR comúnmente utilizada en los estudios de estrongiloidosis. En conclusión, el trabajo que aquí se presenta muestra: (i) la eficacia del método LAMP género-específico de Schistosoma para la detección de formas híbridas de S. haematobium/S. bovis; (ii) el desarrollo, por primera vez, de un método LAMP múltiplex que detecta simultáneamente y a tiempo real S. mansoni y Strongyloides spp.; (iii) su eficacia utilizando reactivos estabilizados y almacenados a temperatura ambiente; (iv) un mayor rendimiento diagnóstico del método Strong-LAMP en el diagnóstico de campo de la estrongiloidosis frente a los métodos parasitológicos convencionales y otros métodos moleculares como la qPCR en el laboratorio; (v) la utilidad del método Strong-LAMP como método de diagnóstico point-of-care de la estrongiloidosis.