Estrategias de funcionalización alternativas de la micotoxina alternariol y desarrollo de métodos inmunoquímicos para el análisis rápido de alimentos

Laburpena

El alternariol es un metabolito secundario producido por hongos del género Alternaria que se puede encontrar a concentraciones relativamente altas (μg/kg) en numerosos alimentos de origen vegetal. Debido a su toxicidad, con efectos mutagénicos y carcinogénicos demostrados, está considerado una amenaza emergente para la salud animal y humana. Por estos motivos, la Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria (EFSA) ha establecido límites máximos tolerables de ingesta diaria de esta micotoxina y recomienda la realización de más estudios y controles en alimentos, particularmente en aquellos destinados al consumo infantil. En consecuencia, se requieren métodos de análisis que permitan la determinación de alternariol en diferentes tipos de alimentos y entornos analíticos. El objetivo de la presente tesis doctoral ha sido el desarrollo y validación de ensayos rápidos para la determinación de esta micotoxina en alimentos empleado diferentes métodos inmunoquímicos, como el ensayo competitivo por inmunoadsorción ligado a enzima (ELISA) y el inmunoensayo de flujo lateral (LFICA), ampliamente utilizados en seguridad alimentaria debido a su simplicidad, bajo coste, portabilidad y alta capacidad de análisis. La síntesis de derivados hapténicos de alternariol ha constituido la primera y más importante etapa para el desarrollo de nuevos métodos inmunoquímicos con prestaciones superiores, en términos de sensibilidad y selectividad, a los descritos previamente. En primer lugar, se han sintetizado tres haptenos regioisoméricos (ALa, ALb y ALm), con cuyos bioconjugados se han generado anticuerpos policlonales de conejo y monoclonales de ratón con excelente afinidad hacia alternariol. Además, se ha demostrado la relación estructura‒función con respecto a la posición del brazo espaciador del hapteno inmunizante y la especificidad de los anticuerpos generados. Con los haptenos ALb y ALm se han obtenido anticuerpos totalmente específicos de alternariol, mientras que el hapteno ALa generó anticuerpos que también reconocían alternariol 9-metil éter con una afinidad similar. Adicionalmente, se han sintetizado tres haptenos heterólogos (AMEb, ALh1 y ALh2) para la optimización de los inmunoensayos. A continuación, utilizando las mejores combinaciones anticuerpo/conjugado se han desarrollado inmunoensayos tipo ELISA, en diferentes formatos, y tiras inmunorreactivas capaces de determinar alternariol a concentraciones subnanomolares. Estos inmunoensayos se han validado para la determinación de alternariol en alimentos. El ELISA competitivo en formato directo es capaz de cuantificar alternariol en zumos de pera y manzana, diluidos en tampón fosfato, a 10 y 30 ng/mL, respectivamente, en tan solo 30 min. Por su parte, los límites de cuantificación, determinados experimentalmente, para analizar alternariol fueron de 1 ng/mL en extractos de harina de avena y trigo sarraceno, y de 10 ng/mL en peras. Además, este inmunoensayo ha sido validado mediante comparación estadística de resultados con un método cromatográfico de referencia utilizando muestras de pera infectadas con A. alternata en el laboratorio. Finalmente, la tira inmunorreactiva desarrollada se ha validado para el análisis semicuantitativo de alternariol en zumo de fruta (manzana y pera) y en peras trituradas, siguiendo la normativa europea para métodos de cribado. Este inmunoensayo permite detectar muestras de pera y de zumo de frutas contaminadas con alternariol a concentraciones de 2 y 5 ng/mL, respectivamente, en tan solo 15 min.