iPSCs, CRISPR/Cas9 y protocolos de diferenciación basados en factores de transripción para generar nuevos modelos neuronales y astrociticos del síndorme de Sanfilippo

Resumen

El síndrome de Sanfilippo es una enfermedad rara de almacenamiento lisosomal, con herencia autosómica recesiva. Existen 4 subtipos (A, B, C y D) dependiendo del gen mutado, siendo que todos ellos codifican enzimas implicadas en la degradación del heparán sulfato, el sustrato acumulado en la enfermedad. Este síndrome está caracterizado por una severa y progresiva neurodegeneración, que aparece entre los 3 y 7 años, y para la que aún no existe tratamiento. El objetivo de esta tesis doctoral era generar nuevos modelos celulares de la enfermedad y probar potenciales terapias para este síndrome. En primer lugar, se probó una terapia de reducción de sustrato en fibroblastos de pacientes del síndrome de Sanfilippo tipo C. Se usaron siRNAs contra los genes EXTL2 y EXTL3, que codifican enzimas implicadas de forma específica en la síntesis del heparán sulfato. El objetivo era recuperar el equilibrio entre síntesis y degradación de este sustrato, para evitar su acúmulo. Los resultados fueron prometedores. A continuación, se generaron dos líneas de células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) con mutaciones en el gen HGSNAT, causante del síndrome de Sanfilippo tipo C mediante la tecnología CRISPR/Cas9. Estas iPSCs mantenían su capacidad de diferenciación a muchos tipos celulares, como neuronas y astrocitos. Estos tipos celulares son de gran relevancia en el síndrome de Sanfilippo dada su sintomatología principalmente neurodegenerativa. Se usaron estas iPSCs obtenidas con CRIPSR/Cas9, así como otras derivadas de un paciente del síndrome de Sanfilippo C, para generar neuronas y astrocitos como modelos celulares de esta enfermedad. La diferenciación se llevó a cabo mediante protocolos basados en la sobreexpresión de factores de transcripción, previamente descritos. Se confirmó la presencia de marcadores típicos de neuronas y astrocitos tras la diferenciación, así como la recapitulación de fenotipos clave de la enfermedad, como el acúmulo de heparán sulfato. Dado que estos nuevos modelos celulares son herramientas útiles para probar diferentes aproximaciones terapéuticas, se evaluó la efectividad de la terapia de reducción de sustrato que se había probado en fibroblastos de paciente. Se usó el siRNA que había mostrado mejores resultados en fibroblastos, y que tenía como diana el gen EXTL2. Aunque a los tres días de haber transfectado el siRNA, tanto neuronas como astrocitos mostraban una inhibición del 70-80% en la expresión de EXTL2, el acúmulo de heparán sulfato no presentaba ninguna reducción en neuronas. La evaluación de dicho acúmulo en astrocitos sería de gran interés, pero en cualquier caso estos resultados demuestran la utilidad de probar posibles estrategias terapéuticas en tipos celulares relevantes para la enfermedad, ya que la dinámica celular puede variar los resultados. Generar estos modelos celulares neuronales y astrocíticos puede resultar muy útil para los otros subtipos del síndrome de Sanfilippo, y por ello se generaron de nuevo dos líneas mutantes de iPSCs mediante la tecnología CRISPR/Cas9, esta vez con mutaciones en el gen NAGLU, causante del síndrome de Sanfilippo tipo B. De nuevo, estas iPSCs mantenían su capacidad de diferenciación a tipos celulares como neuronas y astrocitos. Como conclusión, en esta tesis doctoral se han conseguido generar nuevos modelos celulares para los síndromes de Sanfilippo B y C. Además, para el subtipo C se vio que, aunque la inhibición mediante siRNAs de EXTL2 resultara una estrategia terapéutica prometedora cuando se probaba en fibroblastos de pacientes, no era una estrategia efectiva en tipos celulares más relevantes para la enfermedad como son neuronas y astrocitos.