Evaluation of Advanced Analytical Methodologies for the Control of Pesticides and Natural Toxins in Waters, Food and Nutraceuticals

Resumen

En esta Tesis se han propuesto diferentes estrategias analíticas usando diferentes técnicas para la determinación de residuos del insecticida fipronil y sus metabolitos y de cianotoxinas en productos alimenticios y aguas medioambientales. Fipronil es un insecticida derivado de la familia de los fenilpirazoles, el cual es conocido por perturbar el canal de cloruro regulado por el ácido γ-aminoburírico (GABA) de las membranas celulares en el sistema nervioso central. La perturbación por fipronil de los receptores de GABA impide la captación de iones cloruro, lo que provoca un exceso de estimulación neuronal y la muerte del insecto. Aunque se sabe que este insecticida tiene una mayor afinidad de unión a los complejos receptores de los insectos, a veces sus efectos son negativos en otros organismos como los vertebrados y los seres humanos y por tanto en la Unión Europea (UE) está autorizado como medicamento antiparasitario para animales de compañía, pero no para animales productores de alimentos. Además, se sabe que fipronil-sulfona, el principal metabolito biológico del fipronil, es veinte veces más activo en los canales de cloruro de los mamíferos que en los de los insectos. En el caso de los alimentos, la legislación vigente establece límites máximos de residuos (LMR), que no deben superarse para garantizar la calidad del producto y permitir su distribución y consumo. La aprobación del fipronil como insecticida en agricultura expiró en 2017 y, por tanto, en el reglamento (UE) 2019/1792 se modificó su LMR (como suma de fipronil y fipronil sulfona) establecidos para alimentos, fijado en el límite de determinación analítica, proponiéndose un valor de 0,005 mg/kg. Sin embargo, las malas prácticas o los errores de manipulación hacen que se encuentren residuos de este pesticida o su metabolito principal en alimentos que a veces se supera este valor. Si esto ocurre, las alertas sobre su presencia en alimentos de origen animal destinados al consumo humano se notifican a través del portal del Sistema de Alerta Rápida para Alimentos y Piensos (RASFF), que proporciona a las autoridades de la UE una herramienta para el intercambio de información sobre las medidas adoptadas cuando se detecta un riesgo en piensos o alimentos. Así ocurrió con el incidente de la alerta sanitaria ocurrido en 2017 en Europa como consecuencia de la contaminación por fipronil de huevos de granjas de los Países Bajos y Bélgica destinados al consumo humano. Por otro lado, la presencia no sólo de plaguicidas, sino de toxinas naturales emergentes es un tema de interés y concienciación. Las cianotoxinas son metabolitos secundarios tóxicos producidos por algunos géneros de cianobacterias, también conocidas como algas verdeazuladas. Las cianobacterias son un grupo de procariotas oxigénicas que habitan en una gran variedad de ecosistemas marinos y de agua dulce, y en determinadas condiciones, como en medios con altos niveles de nutrientes, se reproducen exponencialmente formando floraciones. Como resultado, las cianotoxinas presentes en el agua pueden afectar negativamente a diferentes especies y acumularse en animales como peces y mariscos, causando intoxicaciones a través de la cadena alimentaria. De hecho, las cianotoxinas pueden estar presentes en diferentes productos alimenticios como son los complementos dietéticos a base de cianobacterias. En las cianotoxinas se incluyen potentes neurotoxinas, hepatotoxinas y citotoxinas, compuestos con una gran variedad de estructuras y propiedades físico-químicas. Sin embargo, la toxicidad de estos compuestos no se ha estudiado aún en profundidad y, por tanto, la Organización Mundial de la Salud (OMS) ha establecido un valor regulado para agua potable de 1 μg/L solo para la cianotoxina más estudiada, la microcistina-LR. En relación con toda la problemática anterior, es evidente que se requieren métodos analíticos sensibles, selectivos y eficaces para la determinación de estos compuestos en el ámbito de la seguridad alimentaria y medioambiental para: a) Controlar la concentración de residuos y metabolitos de plaguicidas, en concreto de fipronil y su metabolito, fipronil sulfona, para garantizar la calidad y seguridad de los productos alimentarios y cumplir con la legislación europea vigente. b) Estudiar y evaluar la presencia y los potenciales riesgos para la salud asociados a compuestos tóxicos naturales, como las cianotoxinas, menos estudiados o emergentes. En general, para hacer frente a los restos analíticos mencionados, se han considerado distintas técnicas. Los métodos propuestos se basan en técnicas de separación miniaturizadas, como la electroforesis capilar (CE) y la cromatografía líquida capilar (CLC), ya que implican un bajo volumen de muestra y un bajo consumo de disolventes y de generación de residuos, siendo recomendada como una técnica analítica verde. Además, también se ha investigado el uso de técnicas de alta eficiencia, como la cromatografía líquida de ultra alto rendimiento (UHPLC), ya que ofrece un menor consumo de disolvente que los métodos LC convencionales, una mayor eficiencia y un tiempo de análisis más corto. Además de la detección UV-Vis, en esta Tesis se ha considerado la espectrometría de masas (MS) debido a sus ventajas, como una mayor sensibilidad y selectividad y su capacidad para identificar inequívocamente un gran número de compuestos. Por último, se ha evaluado el acoplamiento de la espectrometría de movilidad iónica (IMS) al flujo de trabajo LC acoplado a espectrometría de masas de alta resolución (LC-HRMS), ya que proporciona información complementaria mediante el parámetro denominado sección transversal de colisión (CCS) que puede derivarse de dicha técnica. Al mismo tiempo, se han investigado métodos de tratamiento de muestra para lograr la extracción y preconcentración de los analitos de manera adecuada. Cabe destacar que en esta Tesis se ha intentado llevar a cabo aportaciones novedosas explorando metodologías alternativas a las convencionales para abordar estos problemas. Así, se ha desarrollado la primera aplicación de la electroforesis capilar en la determinación de fipronil y sus metabolitos en muestras de huevo. Además, se aborda por primera vez la determinación conjunta de cianotoxinas de diversas familias y por tanto con características físico-químicas muy diferentes y la caracterización en términos de CCS de un gran número de cianotoxinas empleando movilidad iónica de onda viajera (TWIMS) acoplada a espectrometría de masas de alta resolución con analizador de cuadrupolo-tiempo de vuelo (QTOF-HRMS). Esta Tesis se ha dividido en dos partes diferenciadas. La Parte I presenta una introducción que incluye aspectos relevantes relacionados con los insecticidas objeto de estudio y recopila el trabajo experimental desarrollado. En esta parte se incluyen los siguientes capítulos: • El Capítulo 1 describe un método basado en CE en su modo de cromatografía electrocinética micelar (MEKC) con detección por batería de diodos (DAD) como un enfoque novedoso para la determinación de fipronil y su principal metabolito, fipronil-sulfona en muestras de huevos de gallina. Con este fin se desarrolló un tratamiento de muestra basado en la extracción líquido-líquido asistida por sales (SALLE) para extraer eficientemente los analitos. • El Capítulo 2 trata del empleo de la CLC acoplada a DAD como técnica miniaturizada para la separación y determinación de fipronil y dos de sus principales metabolitos, fipronil-sulfona y fipronil-sulfuro, en muestras de huevos de gallina. SALLE fue la técnica de extracción empleada para extraer los analitos diana de la matriz de interés. Por otro lado, en la Parte II se ofrece una introducción con información de interés sobre las cianobacterias, cianotoxinas y métodos de análisis, así como los métodos desarrollados en esta Tesis para dichos analitos. En esta parte se encuentran los siguientes capítulos: • El Capítulo 3 incluye un estudio exhaustivo de la determinación de cianotoxinas de diferentes familias en muestras de agua de embalses mediante cromatografía líquida de interacción hidrofílica (HILIC) acoplada a detección MS en tándem (MS/MS). Para lograr la extracción simultánea de los analitos se desarrolló un novedoso método de tratamiento de muestra basado en la extracción en fase sólida (SPE) en tándem. • El Capítulo 4 consiste en el desarrollo de un método basado en HILIC-MS/MS para la determinación de cianotoxinas de diferentes familias en suplementos dietéticos basados en cianobacterias. Se empleó un tratamiento de muestra basado en extracción sólido-líquido (SLE) seguido de una SPE en tándem. El método se aplicó a diferentes muestras de suplementos dietéticos para estudiar la presencia de cianotoxinas y evaluar el riesgo potencial para la salud. • El Capítulo 5 presenta la investigación realizada bajo la supervisión de las profesoras Dra. Laura Righetti y Dra. Chiara Dall’Asta durante la estancia de investigación predoctoral en la Universidad de Parma (Parma, Italia). El trabajo consistió en el desarrollo de una base de datos de CCS como un parámetro complementario para la caracterización de 20 cianotoxinas y una biotoxina marina empleando un método de movilidad iónica de onda viajera acoplado a espectrometría de masas de cuadrupolo-tiempo de vuelo (TWIMS-QTOF-MS). Se discutieron los resultados obtenidos y posteriormente se llevó a cabo un cribado de cianotoxinas en varias muestras de suplementos dietéticos para evaluar su presencia.