Edición génica del gen serpina1 mediante el uso de crispr/cas9 en células sanguíneas de pacientes con déficit de alfa-1 antitripsina

Resumen

Introducción. El déficit de alfa-1 antitripsina (DAAT) es una enfermedad rara caracterizada por niveles bajos en sangre de una proteína denominada alfa-1 antitripsina (AAT), principal enzima antiproteasa del suero. El DAAT está provocado por mutaciones en el gen SERPINA1, que codifica para la AAT. Las dos mutaciones más frecuentes se denominan Pi*Z y Pi*S, provocando la primera una sintomatología más grave. A la variante normal se le denomina Pi*M. CRISPR/Cas9 es una herramienta de edición génica adaptada del sistema de inmunidad adquirida presente en bacterias y arqueas que consiste en una endonucleasa, Cas9, guiada por una molécula de RNA simple (sgRNA), complementaria al gen diana. Objetivos. Generar una línea celular estable mediante inmortalización de células procedentes de pacientes con DAAT. Editar la mutación Pi*Z del gen SERPINA1 primero en líneas celulares establecidas y finalmente, en la línea celular de DAAT generada. Metodología. Para la inmortalización de líneas celulares se realizaron tanto infecciones virales como transfecciones no virales para inducir la expresión del antígeno T grande de SV40, la subunidad catalítica de la telomerasa humana o la quinasa 4 dependiente de ciclina en monocitos primarios. Finalmente, se procedió a la inmortalización de linfocitos B de pacientes mediante infección con el virus de Epstein-Barr. Las líneas celulares obtenidas se caracterizaron mediante el ensayo de expresión génica del gen SERPINA1 y la determinación del número de copias del gen por qPCR, el genotipado mediante secuenciación Sanger y la detección de la proteína AAT en los lisados celulares mediante Western Blot. Para la edición de la mutación Pi*Z se diseñaron tres sgRNA que fueron testadas inicialmente en la línea celular HEK293. Posteriormente, se transfectaron monocitos primarios y macrófagos derivados de monocitos y, por último, los linfocitos B inmortalizados. Para las transfecciones se utilizaron ribonucleoproteínas formadas por la Cas9 y las sgRNA que se introdujeron en las células mediante la formación de lipoplejos y electroporación. Para validar las sgRNA se utilizó el ensayo de la endonucleasa T7. Resultados. La inmortalización de monocitos primarios no fue posible con ninguno de los métodos probados, aunque se producían alteraciones del cultivo, no se mantuvo la proliferación del mismo durante largos períodos de tiempo. Sin embargo, la inmortalización de linfocitos B dio lugar a cuatro líneas de genotipo: Pi*MM, Pi*MS, Pi*SS y Pi*MZ. La expresión de AAT en estas líneas se pudo detectar tanto a nivel de transcripción mediante qPCR como de síntesis proteica mediante Western Blot. Se comprobó que el porceso de transformación no había alterano ni el número de copias del gen ni el genotipo de los donantes. El ensayo de la endonucleasa T7 permitió detectar que las sgRNA diseñadas fueron capaces de editar de forma no homóloga la mutación Pi*Z tanto en la línea HEK293 como en monocitos primarios y macrófagos derivados de monocitos y en los linfocitos B inmortalizados. Conclusiones. Se han generado cuatro líneas de linfocitos B con diferentes fenotipos del DAAT y se ha descrito por primera vez que estas células son productoras de AAT. El sistema CRISPR/Cas9 con las sgRNA diseñadas ha sido capaz de editar de forma no homóloga la mutación Pi*Z del gen SERPINA1 tanto en la línea celular HEK293, como en monocitos primarios, macrófagos derivados de monocitos y linfocitos B inmortalizados.