Papel de la comunicación intercelular hepática en la fisiopatología y el desarrollo de nuevos biomarcadores en la cirrosis

Résumé

Título: Papel de la comunicación intercelular hepática en la fisiopatología y el desarrollo de nuevos biomarcadores en la cirrosis. Introducción: La cirrosis representa el estadio avanzado común a muchas enfermedades hepáticas crónicas, constituyendo un grave problema de salud a nivel mundial y causando alrededor de 2 millones de muertes cada año. Las etiologías más comunes de esta enfermedad son: el abuso de alcohol, las infecciones por parte de los virus hepatotrópicos B y C, y las hepatopatías derivadas de enfermedad metabólica. La reiterada exposición de las células hepáticas a los efectos nocivos de las antes mencionadas etiologías determina una profunda alteración de los programas y vías de comunicaciones celulares que se refleja en una drástica modificación de la arquitectura y de las funciones hepáticas conduciendo al desarrollo de cirrosis y la manifestación clínica de la hipertensión portal (HP), que representa la primera causa de muerte en el paciente cirrótico. Hipótesis: En la presente tesis, se hipotetiza que a lo largo de la progresión de la enfermedad hepática crónica (CLD) hacia la cirrosis, las células del sinusoide hepático generan un conjunto de vesículas extracelulares y factores solubles que, variando cuanti y cualitativamente conforme el estadio de la enfermedad, puedan contribuir a la perpetuación de la misma representando, al mismo tiempo, una potencial fuente de nuevos biomarcadores. Objetivos: Los principales objetivos fueron la caracterización del contenido del secretoma endotelial en un modelo pre-clínico durante la progresión de CLD hacia la cirrosis para explorar su función en la comunicación intrahepática y la evaluación del potencial de los microARNs como biomarcadores no invasivos en pacientes con cirrosis descompensada. Métodos: Se han utilizados cultivos primarios de las principales poblaciones hepáticas [hepatocitos, células endoteliales sinusoidales (LSECs), células estrelladas hepáticas (HSCs), y macrófagos hepáticos (HMΦs)] aisladas de ratas sanas, de modelos pre-clínicos de CLD o de tejidos humanos. Se ha profundizado en la caracterización del transcriptoma de la población CD32b+ de LSECs humanas y de LSECs de un modelo pre-clínico durante la progresión de la CLD. El secretoma endotelial obtenido tras el cultivo in vitro fue fraccionado para estudiar el efecto y el contenido de las fracciones sobre las células hepáticas vecinas. Se ha caracterizado principalmente el proteoma de la fracción representada por las vesículas extracelulares pequeñas (sEVs) debido a su creciente documentado impacto sobre la transferencia horizontal de moléculas bioactivas capaces de modificar el fenotipo de las células receptoras. Paralelamente se ha estudiado el papel los microARNs, aislados a partir de hepatocitos humanos y de suero de pacientes, como biomarcadores circulantes potencialmente hábiles en predecir la respuesta del paciente cirrótico descompensado al tratamiento con beta-bloqueantes no selectivos (NSBBs). Principales resultados: La secuenciación de ARN total de LSECs humanas y de 3 modelos pre-clínicos de CLD, nos ha permitido describir un conjunto de genes implicados en la regulación de los procesos de comunicación intercelular principalmente implicados en la biogénesis y exocitosis de vesículas extracelulares. Quisimos profundizar el impacto del secretoma endotelial a lo largo de la progresión de la CLD en un modelo pre-clínico de cirrosis, averiguando los efectos angiocrinos a diferentes estadios de la CLD en experimentos in vitro de co-cultivo con hepatocitos, HSCs y HMΦs. Pudimos entonces determinar un marco cronológico en la progresión de la CLD experimental en el que el secretoma endotelial fue capaz de determinar cambios fenotípicos en las demás células hepáticas. Caracterizamos entonces el contenido proteico de las vesículas extracelulares endoteliales a lo largo de la progresión de la CLD, observando características estadio específicas, incluyendo la sobre-expresión de tropomiosina-1. Mediante algunos experimentos prueba-de-concepto, describimos los potenciales efectos desactivadores de la tropomiosina-1 sobre las HSCs cirróticas. Paralelamente, detectamos en suero humano una firma de microARNs identificada en el secretoma de hepatocitos primarios humanos cultivados in vitro cuya asociación con la cirrosis no había sido todavía descrita. Se hizo un análisis de las posibles funciones reguladas por parte de los microARNs y observamos su implicación en la regulación de genes relacionados con la respuesta celular a la hipoxia y el control de los procesos apoptóticos. A continuación, valoramos el potencial de los microARNs de la firma como potenciales biomarcadores de la cirrosis descompensada correlacionando su expresión con los parámetros hemodinámicos y clínicos de una cohorte de pacientes bien definida. Los microARNs demostraron un poder predictivo positivo al identificar la respuesta hemodinámica en los pacientes descompensados tratados con NSBBs. Conclusiones: La progresión de la enfermedad hepática crónica cursa con cambios crono-biológicos significativos en los mecanismos de comunicación intercelular dentro del sinusoide hepático, que a su vez son determinantes en la modulación del fenotipo de las células hepáticas. La caracterización del contenido del secretoma hepático puede permitir el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas para el paciente cirrótico además de representar un nuevo recurso para desarrollar biomarcadores con un potencial valor diagnóstico y pronóstico.