Búsqueda de biomarcadores epigenéticos y farmacogenómicos asociados con la respuesta a fármacos biológicos en la psoriasis moderada-grave

Resumen

INTRODUCCIÓN La psoriasis es un trastorno cutáneo inflamatorio crónico e inmunomediado que afecta al 2-3% de la población mundial. Aunque la etiología de la psoriasis no se comprende completamente, se ha visto que los cambios epigenéticos, como la metilación del ADN y las modificaciones de las histonas, están involucrados en esta enfermedad y que dichas modificaciones epigenéticas podrían explicar las diferencias interindividuales en la respuesta a las distintas terapias farmacológicas (farmacoepigenética). El elevado coste de los fármacos biológicos en la psoriasis, la respuesta insuficiente en algunos pacientes y aunque excepcionalmente, la presencia de efectos adversos graves o reacciones psoriasiformes paradójicas nos planteó la necesidad de estudiar biomarcadores no invasivos que pudieran predecir la respuesta a los distintos fármacos biológicos para conseguir así una mayor individualización del tratamiento. Además, a nivel clínico, nos encontramos con distintos fenotipos clínicos, aparición de comorbilidades, una mayor prevalencia y gravedad en varones… es por ello que nos planteamos si estas diferencias observadas podrían explicarse por mecanismos epigenéticos (como diferencias en la metilación del ADN) o farmacogenéticos (como variaciones en el número de copias o CNVs). OBJETIVOS GENERALES Estudio de la influencia de la epigenética en psoriasis tanto a nivel clínico como terapéutico. Inicialmente, realizamos la búsqueda biomarcadores epigenéticos (metilación del ADN, modificación de histonas) y farmacogenéticos (CNVs) que pudieran ser predictores de respuesta a fármacos biológicos en psoriasis. Además, dentro del estudio de la farmacogenética y farmacogenómica, nos planteamos si las diferencias observadas a nivel clínico-terapéutico en práctica clínica de los diferentes fenotipos de psoriasis, la mayor prevalencia y gravedad en el sexo masculino o el desarrollo de reacciones psoriasiformes paradójicas en algunos pacientes en tratamiento con anti-TNF podría explicarse en parte, por variaciones en el CNVs o por otros mecanismos farmacogenómicos. 1. Estudios 1 y 2: 1.1 Objetivos específicos: - Identificar biomarcadores epigenéticos (metilación ADN (Estudio 1); modificación de histonas 8 (Estudio 2) que puedan predecir la respuesta a fármacos biológicos en pacientes con psoriasis moderada-grave. 1.2 Material y métodos: - Estudio 1: Se aisló ADN de células de sangre periférica de pacientes con psoriasis moderadagrave tratados con fármacos anti-TNF. La eficacia de dichos fármacos se evaluó mediante el PASI (Psoriasis Area and Severity Index). Los pacientes que lograron una mejora del 90% sobre su PASI basal (PASI90) se consideraron excelentes respondedores (ER) y los pacientes que no lograron una mejora del 75% sobre el PASI basal (PASI75) se consideraron parcialmente respondedores al tratamiento (PR). Las muestras de ADN se pre trataron y convirtieron con bisulfito y posteriormente se hibridaron en un microarray de metilación Illumina Infinium Human Methylation 450k BeadChip (Illumina Inc., San Diego, CA, USA). Los datos de metilación se corrigieron para determinar la heterogeneidad celular mediante la estimación y el ajuste de las proporciones de tipo celular en nuestras muestras de ADN sanguíneo. Los valores de metilación se ajustaron por edad y sexo de los pacientes. - Estudio 2: Se aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMCs, peripheral blood mononuclear cells) de pacientes con psoriasis tratados con fármacos biológicos antes y después de la administración del fármaco y de sujetos sanos. Posteriormente, se extrajeron las histonas de las PBMCs. Cuatro modificaciones de histonas (acetilación de H3 y H4, y metilación de H3K4 y H3K27) se determinaron mediante ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas o ELISA. Como el 28% de estos pacientes también presentaba artritis psoriásica (APs), el análisis anterior se repitió en los subgrupos de pacientes con o sin APs. Los datos fueron analizados estadísticamente por el software IBM-SPSS v.23. 1.3 Resultados: - Estudio 1: No se encontraron diferencias entre ER y PR, pero tres CpG (cg09141835 (CBFA2T3), cg23446055 (PRELID2) y cg03242666 (PMP22)) mostraron una asociación significativa con la respuesta PASI a los 6 meses. Además, se encontró que tres sitios CpG (cg18837178 (no codificante), cg23132469 (TAS1R2), cg05221720 (COL9A1)) estaban hipermetilados en pacientes PR a adalimumab (n = 4) en comparación con los ER (n = 21). 9 - Estudio 2: Los pacientes con psoriasis presentaron niveles reducidos de acetilación de H3 y H4 y niveles aumentados de metilación de H3K4 en comparación con los controles sanos. Se observaron cambios significativos en la metilación de H3K27 entre ER y PR a fármacos biológicos a los 3 meses. En pacientes sin APs, se encontraron cambios significativos en la metilación de H3K4 entre ER y PR a fármacos biológicos a los 3 y 6 meses. 1.4 Conclusiones: - Existen tres sitios CpG: cg18837178 (no codificante), cg23132469 (TAS1R2), cg05221720 (COL9A1) que están hipermetilados en pacientes PR a adalimumab. - Existe una asociación significativa entre los valores de metilación de tres CpGs: cg09141835 (CBFA2T3), cg23446055 (PRELID2) y cg03242666 (PMP22) y la respuesta de PASI a los 6 meses de tratamiento con fármacos anti-TNF. - Los pacientes con psoriasis presentan niveles reducidos de acetilación de H3 y H4 y niveles aumentados de metilación de H3K4 en comparación con los controles sanos. - Existen diferencias significativas en la metilación de la histona H3K27 entre los pacientes ER y PR a los fármacos biológicos. 2. Estudios 3 y 4: 2.1 Objetivos específicos: Identificar a lo largo de todo el genoma CNVs capaces de explicar y predecir: - Respuesta a fármacos anti-TNF en pacientes con psoriasis. - Aparición de reacciones psoriasiformes paradójicas inducidas por anti-TNF. - Las diferencias clínico-terapéuticas que se encuentran en la práctica clínica en los diferentes fenotipos clínicos de la psoriasis. - Existencia de diferencias genéticas entre la PPP inducida por anti-TNF y la psoriasis pustulosa palmo-plantar (PsoPPP). 2.2 Material y métodos: 10 - Estudio 3: Se emplearon las muestras de sangre periférica de los pacientes del estudio 1 y posteriormente las CNVs se obtuvieron a partir de nuevo análisis de los datos de metilación utilizando paquetes R como conumee y ChAMP. - Estudio 4: Se recogieron muestras de piel lesional y no lesional de pacientes con diferentes fenotipos clínicos de psoriasis, y muestras de piel lesional de pacientes con PPP inducida por fármacos anti-TNF. Las muestras fueron convertidas e hibridadas con bisulfito con microarrays de metilación Illumina Infinium Human Methylation EPIC Beadchip (Illumina Inc., San Diego, CA, USA). Los datos IDAT (Illumina BeadArray Data) de los microarrays se procesaron para la identificación de CNVs utilizando el paquete R conumee. Los valores de p ajustados por la corrección de Bonferroni <0,05 se consideraron significativos. 2.3 Resultados: - Estudio 3: Encontramos 1 CNV que alberga un gen (CPM) asociado significativamente con la respuesta a adalimumab. Además, identificamos 1 CNV que alberga 3 genes (ARNT2, LOC101929586 y MIR5572) relacionados con el desarrollo de reacciones psoriasiformes paradójicas. - Estudio 4: No se encontraron diferencias significativas en las CNVs entre los diferentes fenotipos y localizaciones de la psoriasis. Sin embargo, encontramos 2 “bins” significativos que albergaban 5 genes diferentes (LOC100129540, MIR599, MIR875 RASGRF1 y VPS13B) asociados con la PPP inducida por anti-TNF. 2.4 Conclusiones: - Estudio 3: Hemos identificado CNVs que podrían predecir la respuesta a adalimumab y el desarrollo de reacciones psoriasiformes paradójicas por fármacos anti-TNF. - Estudio 4: Las CNVs no parecen estar involucrados en la patogénesis de los diferentes fenotipos clínicos de psoriasis. Sin embargo, nuestros resultados pueden ayudar a predecir qué pacientes con otras enfermedades inflamatorias podrían desarrollar una PPP inducida por anti-TNF. 11 3. Estudio 5: 3.1 Objetivos específicos: - Análisis de las diferencias de metilación del ADN asociadas al sexo en pacientes con psoriasis, para así identificar marcadores de metilación específicos asociados al sexo en la psoriasis. - Análisis de las diferencias en los mecanismos moleculares de la psoriasis en cada sexo. 3.2 Material y métodos: - Analizamos las bases de datos de microarrays de metilación disponibles en el repositorio de datos Gene Expression Omnibus (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) procedentes de muestras de piel de pacientes con psoriasis: GSE63315, GSE73894 y GSE115797. Todas estas bases de datos se generaron con microarrays de metilación Illumina Infinium Human Methylation 450k BeadChip (Illumina Inc., San Diego, CA, USA). Los valores de metilación se compararon entre mujeres y hombres utilizando la herramienta de análisis GEO2R (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/) y el paquete de R limma, centrándonos en aquellos genes que albergaban sitios CpGs diferencialmente metilados o DMS comunes a todas las bases de datos y que presentaban diferencias entre psoriasis y controles sanos en hombres y mujeres de forma independiente. Posteriormente, realizamos un análisis de enriquecimiento utilizando Enrichr (https://amp.pharm.mssm.edu/Enrichr/) para identificar vías de señalización y funciones biológicas caracterizadas para cada sexo. 3.3 Resultados: - Se analizaron las diferencias de metilación entre la piel lesional y los controles en mujeres y hombres por separado y obtuvimos los DMS comunes a las diferentes bases de datos. Se observó que había 285 genes con DMS encontrados exclusivamente en mujeres, 4476 genes encontrados exclusivamente en varones y 2170 genes comunes a ambos sexos. Luego, se analizó las cascadas de señalización donde se ubicaban estos DMS y descubrimos que según la enciclopedia KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) las rutas de señalización asociadas con los DMS comunes a hombres y mujeres eran: guía de axones, vías en el cáncer, rutas de señalización Rap1, adhesión focal e infección por virus del papiloma humano. En los DMS exclusivos de varones se 12 encontró un enriquecimiento en las siguientes vías: vías en el cáncer, vía de señalización PI3K Akt, vía de señalización de calcio, vía de señalización de MAPK y vía de señalización del hipocampo. Sin embargo, no se encontró ninguna vía significativamente asociada con los biomarcadores de la psoriasis exclusivamente en mujeres. Según las bases de datos dbGAP, existe un patrón ligeramente diferente de comorbilidades asociadas entre DMS que se encuentran exclusivamente en los varones y en ambos sexos. 3.4 Conclusiones: - Existen diferencias de metilación del ADN asociadas al sexo en pacientes con psoriasis que pueden influir en los mecanismos moleculares de la psoriasis en cada sexo. En hombres encontramos un mayor número de DMS lo que podría estar asociado con la mayor severidad que presentan. Hemos encontrado DMS que podrían actuar como biomarcadores específicos para predecir el desarrollo de comorbilidades en ambos sexos. CONCLUSIONES GENERALES A nivel farmacoepigenético, nuestros hallazgos en las diferencias de metilación del ADN y modificaciones de histonas en pacientes con psoriasis, sientan las bases para el progreso en la búsqueda de nuevos biomarcadores farmacoepigenéticos para la predicción de la respuesta a los fármacos biológicos en la psoriasis. Además de la predicción de la respuesta terapéutica, el estudio en profundidad de estos mecanismos epigenéticos, nos puede ayudar a comprender mejor los mecanismos moleculares que subyacen a las diferencias entre hombres y mujeres con psoriasis, así como anticiparnos a las posibles comorbilidades que puedan llegar a desarrollar nuestros pacientes. No obstante, se necesitan estudios con en cohortes independientes para confirmar estos resultados. El estudio y aplicación del análisis de CNVs a la farmacogenómica de la psoriasis nos ha permitido identificar posibles CNVs predictores de respuesta a adalimumab y del desarrollo de reacciones psoriasiformes paradójicas por fármacos anti-TNF. Es cierto que la aplicabilidad clínica de la farmacogenómica y de la farmacogenética en la psoriasis es limitada, pues múltiples variantes pueden afectar al tratamiento biológico, sin embargo, la profundización en el estudio de dicha variabilidad genética y de los cambios epigenéticos que puedan afectar a la expresión génica puede ayudar a conseguir marcadores clínicos, diagnósticos y terapéuticos que nos permitan ejercer una terapia cada vez más personalizada en nuestros pacientes.