Regulación de la biosíntesis de isoprenoides en plantasestudio molecular del control de la vía a nivel de la enzima hmg-coa reductasa

Abstract

La existencia de clones de cDNA de las diferentes unidades transcripcionales que dirigen la síntesis de las tres isoformas de esa enzima de Arabidopsis thaliana permitía intentar alterar los niveles de expresión de la actividad HMGR a fin de: 1,- Determinar si HMGR limita la síntesis de esteroles en plantas. 2,- Caracterizar los mecanismos que regulan la expresión génica y actividad HMGR en Arabidopsis. 3,- Determinar posibles diferencias entre las localizaciones subcelulares y respectivas funciones de las diferentes isoformas HMGR de Arabidopsis (HMGR1S, HMCR1L y HMGR2). Para ello, se generaron plantas transgénicas en las que los cDNA de las tres isoformas se colocaron bajo el control de un promotor fuerte y de expresión constitutiva (CaMV 35S). Asimismo, se generaron plantas diseñadas para intentar expresar los dominios catalíticos de HMGR1S y HMGR2, a fin de estudiar las posibles funciones reguladoras de los dominios hidrofóbicos que anclan estas proteínas al retículo endoplasmático, según se ha descrito en animales, plantas y levaduras. Se generó un número variable de líneas transgénicas independientes para cada una de las construcciones utilizadas y las diferentes líneas fueron llevadas hasta homozigosis. Entonces, un número representativo de líneas de cada construcción fue analizado: 1,- Mediante Nothern blot, para estudiar los niveles de expresión de los transgenes. 2,- Mediante Western blot, para analizar los niveles de acumulación de las proteínas expresadas. 3,- Mediante medidas de actividad HMGR. 4,- Mediante medida de los niveles de esteroles, utilizando cromatografía de gases. 5,- Mediante estudio de los fenotipos y análisis ultraestructural (microscopía electrónica de transmisión). 6,- Mediante técnicas de inmunocitoquímica. El resultado de estos materiales permitió concluir: 1,- La expresión de los genes HMG1 y HMG2 y los niveles de HMGR1S, HMGR1L y HMGR2 vie