Generació i ús de microxips de DNA per a lestudi de la resposta transcripcional a pH alcalí en Saccharomyces cerevisiae

Résumé

La resposta enfront a una situació destrès en microorganismes genera una resposta adaptativa que implica una remodelació en lexpressió gènica. Per estudiar la resposta transcripcional enfront a una situació destrès ens vàrem plantejar una solució atrevida que consistia en lamplificació dels aproximadament 6000 ORFs del genoma sencer de Saccharomyces cerevisiae amb la collaboració dels laboratoris dels Drs. José Enrique Perez-Ortín (Universitat de València) i Javier Arroyo (Universitat Complutense de Madrid) per fabricar nosaltres mateixos microxips de DNA. Un primer ús daquests microxips va ser lestudi de la resposta transcripcional de S. cerevisiae enfront a una situació destrès per pH alcalí. Les respostes moleculars produïdes per variacions del pH extracellular han estat poc estudiades en Saccharomyces cerevisiae a diferència daltres fongs com Aspergillus nidulans, Candida albicans o Yarrowia lipolytica. Quan es va iniciar aquest treball de recerca el nombre de gens de Saccharomyces cerevisiae que es sabia que presentaven una resposta a pH alcalí era sorprenentment petit: ENA1, que codifica un ATPasa de sodi essencial per la destoxificació de sodi, SHC1 i SCY1 dels quals no es coneixia pràcticament res. Per aquest motiu en aquest treball shan utilitzat microxips de DNA fabricats en el nostre laboratori amb lobjectiu de realitzar una millor caracterització de la resposta transcripcional enfront a una situació destrès com és la exposició a pH alcalí. Recentment, sha observat en el nostre laboratori que la calcineurina podria estar involucrada en la tolerància enfront a pH alcalí. Es va demostrar que una part significativa de la resposta a pH alcalí del promotor ENA1 i pràcticament la totalitat de la resposta de PHO89 (codifica una permeasa Na+/Pi) estava bloquejada per linhibidor de la calcineurina FK506 i també en absència de Cnb1 o Crz1 suggerint que la resposta transcripcional duna sèrie de gens enfront a lacalinització del medi podria ser, com a mínim en part, depenent de la calcineurina. El fet que dos dels quatre gens estudiats més exhaustivament presentessin dependència a calcineurina en la seva resposta enfront a pH alcalí ens va fer pensar que un nombre important de gens de llevat podrien respondre a pH alcalí a través de la via de senyalització de la calcineurina. En aquest treball confirmem i ampliem aquesta hipòtesis definint, mitjançant la tecnologia de microxips de DNA, un conjunt de gens la resposta transcripcional dels quals està regulada per la via de la calcineurina. _________________________________________________ Exposure of microorganisms to stress resulted in adaptative changes that involved remodeling the gene expression. To study the transcripcional response to stress we took the daring decision to amplificate the entire Saccharomyces cerevisiae genome (6000 ORFs approximately) in collaboration with Drs. José Enrique Perez-Ortín (Universitat de València) and Javier Arroyo (Universitat Complutense de Madrid) to generate home made microarrays. This microarrays were firstly used to study transcriptional response to alkaline conditions. The study of alkaline response in S. cerevisiae has received little attention compared with other fungi like Aspergillus nidulans, Candida albicans or Yarrowia lipolytica. When this work was initiate, the number of Saccharomyces genes known to be responsive to alkalinization of the medium was surprisingly small: ENA, encoding a P-type Na+-ATPase essential for sodium detoxification, SHC1 and SCY1 of unknown function. For this reason we used home made microarrays to study transcriptional response of yeast cells to an increase of external pH. Recent evidence in our laboratory suggested that the calcium-activated protein phosphatase calcineurin could play a role in alkaline stress signaling. We showed that significant part of the alkaline response of the ENA1 promoter, and most of the PHO89 response, was blocked by the calcineurin inhibitor FK506 as well as by the absence of Cnb1 or Crz1/Tnc1 suggesting that the transcriptional response of certain genes to alkalinization of the medium could be, at least in part, dependent on calcineurin. These findings let us to speculate the possibility that calcineurin pathway could play an important role in transcriptional response to alkaline pH. In this work we confirm this hypothesis by defining, using DNA microarray technology, the subset of genes whose alkaline transcriptional response is mediated by the calcineurin pathway.