Título de la tesiscaracterización de nuevas xilanasas bacterianas. Ingeniería de enzimas con la xilanasa b de paenibacillus barcinonensis

Resumen

A partir de la cepa xilanolítica Bacillus sp. BP-7, previamente aislada y caracterizada en el grupo de investigación, se han clonado e identificado 3 enzimas degradadoras de xilano: XynA, YnfF y XynD. La xilanasa XynA presenta máxima actividad sobre xilano de madera de haya y es homóloga a las xilanasas del subgrupo de pl alcalino y bajo peso molecular de la familia 11. Los resultados del análisis de uso de codón en XynA sugieren que la enzima, altamente conservada en especies del género Bacillus, posiblemente ha sido adquirida por transferencia horizontal de genes entre especies relacionadas de dicho género. Adicionalmente, se ha conseguido diseñar un sistema basado en la proteína Pir4 de Saccharomyces cerevisiae para la expresión y direccionamiento de la xilanasa XynA a la pared celular de levaduras o al medio de extracelular, como primer paso hacia su posible utilización biotecnológica en la industria alimentaria. La xilanasa YnfF de Bacillus sp. BP-7 es una de las pocas xilanasas descritas hasta el momento en la familia 5 de glicosil hidrolasas. YnfF presenta actividad sobre xilanos con ramificaciones de ácido metil glucurónico pero es inactiva sobre xilanos con ramificaciones de arabinosa. La enzima XynD, por su parte, presenta alta homología con enzimas con actividad xilanasa y arabinofuranosidasa que se encuentran clasificadas en la familia 43 de glicosil hidrolasas. Los estudios de aplicación en el blanqueo de pastas de papel de las xilanasas YnfF y XynA demuestran que estas permiten obtener mejoras notables en la blancura del papel. La enzima XynB de Paenibacillus barcinonensis es una xilanasa de la familia 10 con elevada actividad sobre xilanos y sobre aril-xilósidos. Dicha enzima se ha clonado y expresado en cepas de Bacillus subtilis. La máxima producción se ha obtenido con la cepa recombinante B. subtilis MW15/pRBSPO2X20, que contiene el gen xynB bajo el control del promotor SP02. Los estudios de localización celular indican que XynB es un xilanasa intracelular. Su detección en sobrenadantes de cultivos viejos es debida a lisis celular y no a auténtica secreción. Asimismo, XynB de Paenibacillus barcinonensis junto con otras 6 xilanasas altamente homólogas de la familia 10 forman un nuevo subgrupo de xilanasas dentro de dicha familia. Las características comunes de estas xilanasas son la ausencia de péptido señal, y la presencia de 2 secuencias conservadas exclusivas, regiones A y B. También se ha determinado la estructura tridimensional de la xilanasa B mediante cristalografía, observándose que su conformación es de un barril (¿/ß)8. La hendidura catalítica muestra 4 subsitios de unión al sustrato claramente definidos, resaltando la presencia de una cavidad a nivel del subsitio +2, que permitiría acomodar sustituyentes laterales como ácido metil glucurónico. También es de gran importancia el bucle L7, que contiene la región conservada B, para determinar la conformación del centro activo de la xilanasa. Mediante evolución dirigida se han obtenido 4 mutantes termoestables de XynB, cada una de ellas con una de las siguientes sustituciones: E137D, D323N, S15L y M93V. Las variantes con las mutaciones S15L y M93V presentan una vida media claramente superior a la xilanasa salvaje. La combinación de las 2 mutaciones más efectivas (S15L y M93V) en un doble mutante S15L/M93V origina una xilanasa con una vida media a 50° C incrementada más de 20 veces respecto a la enzima salvaje; hacho que se deberla a un efecto sinérgico de las mutaciones introducidas.