Separación y caracterización de rhuepo y nesp`por electroforesis capilar, espectrometría de masas y técnicas inmunoquímicas

Zusammenfassung

El análisis de las glicoformas de la eritropoyetina humana recombinante (rHuEPO) y de su análogo hiperglicosilado NESP es de gran importancia tanto en el control antidopaje para detectar su uso fraudulento en el deporte, como en el control de calidad de estos biofármacos ya que pequeñas variaciones en la composición de sus glicoformas pueden influir negativamente en la efectividad y propiedades de los preparados farmacéuticos. El método recomendado por la Farmacopea Europea (Eur.Ph.) por Electroforesis Capilar (CE) basado en un recubrimiento del capilar con putrescina se utiliza actualmente como método de referencia en el control de calidad de rHuEPO. Este método es excelente para el análisis cualitativo de las glicoformas de la rHuEPO, pero no permite obtener resultados cuantitativos cuando se analiza una mezcla de diferentes eritropoyetinas ya que los perfiles electroforéticos se encuentran muy solapados. En esta tesis doctoral se ha desarrollado un método de calibración multivariante por mínimos cuadrados parciales (PLS), aplicando el método de la Eur.Ph. para determinar la composición de mezclas de rHuEPO alfa y rHuEPO beta, como la rHuEPO BRP. Los resultados obtenidos demuestran el potencial del análisis multivariante para determinar cuantitativamente la composición de una mezcla de glicoproteínas que difieren en su patrón de glicosilación. Por otro lado, en esta tesis doctoral, el método de la Eur.Ph. ha sido utilizado como punto de partida para desarrollar un método de separación de las glicoformas de la NESP. A pesar de las excelentes separaciones que se obtienen con el método de la Eur.Ph., este método no es compatible con la detección por espectrometría de masas (MS) debido a su elevado contenido en urea y sales en el electrolito de separación. Para resolver este inconveniente es necesario desarrollar metodologías alternativas por CE compatibles con la detección por MS para detectar y caracterizar de manera inequívoca los preparados farmacéuticos de rHuEPO y NESP. En esta tesis, se ha desarrollado un método de separación de las glicoformas intactas de la rHuEPO y de la NESP por CE acoplada a la espectrometría de masas por electroesprai con analizador de trampa de iones (CE-ESI-IT-MS). Se han evaluado dos tipos de capilar recubierto con polímeros de poliacrilamida derivatizada (UltraTolTM LN y HR) tanto por lo que se refiere a la separación e identificación de las glicoformas como a la estabilidad del recubrimiento. Por otro lado, el método oficial acreditado por la Agencia Mundial Antidopaje para la detección de rHuEPO y NESP en el control antidopaje es largo, de elevado coste y no permite la confirmación por MS. Por este motivo es necesario desarrollar nuevos métodos de cribado y confirmación de rHuEPO y NESP en sangre y orina basados en la detección por MS para detectar su uso en el dopaje. Los métodos desarrollados por CE-ESI-IT-MS basados en la detección de las glicoproteínas intactas no son, por el momento, suficientemente sensibles para se aplicados en muestras biológicas. Para solventar este incoveniente una opción es la detección de un biomarcador de bajo peso molecular (péptido, carbohidrato y/o glicopéptido) que permita discriminar entre las diferentes eritropoyetinas (endógenas y recombinantes), proporcionando una mayor sensibilidad que la glicoproteína intacta cuando se analiza por MS. En esta tesis, se han analizado mezclas de digestos de rHuEPO y NESP por CE de Inmunoafinidad acoplada a la MS (IA-CE-ESI-MS). Se han seleccionado dos péptidos proteotípicos: EPO (77-97) y NESP (77-97) como péptidos biomarcadores de rHuEPO y NESP, respectivamente. Solo el péptido EPO (77-97) del digesto de rHuEPO fue retenido y detectado por IA-CE-ESI-MS, confirmando la especificidad y selectividad del método desarrollado. Sin embargo, no se pudo detectar ningún péptido a baja concentración. Estos resultados deben ser tenidos en cuenta como punto de partida para la detección selectiva de rHuEPO y sus análogos a los niveles en los que se encuentran en fluidos biológicos. Y finalmente, en esta tesis también se han estudiado las condiciones óptimas para caracterizar glicoproteínas intactas por MS con ionización por desorción con láser asistida por una matriz (MALDI-MS). Se ha evaluado la influencia de diferentes matrices de MALDI y diferentes métodos de cristalización en los espectros de masas de glicoproteínas intactas que presentan diferente grado de glicosilación. Se ha demostrado que algunas matrices de MALDI, ampliamente utilizadas para proteínas, no son adecuadas para el análisis de glicoproteínas ya que son demasiado energéticas, produciendo la fragmentación de los azúcares. Los mejores resultados se han obtenido al utilizar el ácido 2,5-dihidroxibenzoico como matriz de MALDI y cristalizando al vacío. Esta nueva metodología de MALDI-MS permite determinar mejores masas moleculares de glicoproteínas intactas que las obtenidas previamente por otros autores.