Glutatation Transferasas de clase Omega en Saccharomyces cerevisiaeEstudio Bioquímico y Funcional

Resumen

Saccharomyces cerevisiae posseeix dues glutatió transferases (GST) anomenades Gtt1 i Gtt2, amb capacitat de conjugar una molècula de glutatió amb el substrat estàndar CDNB. Aquests dos enzims no són clasificables dins de les classes convencionals descrites en base a l'estructura de les GST d'eucariotes superiors, encara que guarden certa similitud estructural amb els membres de la classe Zeta. En aquesta memòria es descriu la caracterització de tres GST de classe Omega en S. cerevisiae anomenades Gto1, Gto2 i Gto3, codificades respectivament per les ORFs YGR154c, YKR076w i YMR251w. Els enzims d'aquesta classe no tenen activitat sobre CDNB, però són actives com tiol oxidoreductases i posseïxen activitat dehidroascorbat reductasa i dimetilarsenat reductasa. La primera d'elles, Gto1, és peroxisomal i posseïx un senyal de localització de tipus PTS1 en la regió C-terminal. Aquest senyal és reconeguda pel transportador peroxisomal Pex5, que facilita la seva internalizació en aquest organul. D¿altre banda, Gto2 i Gto3 tenen localització citoplàsmica. Els gens GTO de S. cerevisiae s'induïxen per estrès oxidativu però amb patrons distints per als tres gens. La dependència d'aquesta expressió dels factors de trascripció Yap1, Msn2 i Msn4 es relaciona amb la presència de seqüències YRE i STRE en els promotors dels gens GTO. El mutant Dgto1 és sensible a l'agent oxidant diamida i té una concentració intracel· lular de glutatió menor que la soca silvestre. Aquest fenotip es relaciona amb que el triple mutant Dgtt2 Dgtt1 Dgto1 sigui sensible al cadmi, indicant que les tres GST Gtt1, Gtt2 i Gto1 intervenen en la detoxificació d'aquest metall. Altre fenotip rellevant és la dificultat del mutant Dgto1 per a créixer en medis de cultiu amb àcid oleic com única font de carboni, indicant que les funcions peroxisomals en el mutant estan afectades. L'absència de GTO1 en S. cerevisiae causa així mateix el descens en l'expressió de gens involucrats en la via de síntesi de cisteïna i metionina. Com a conseqüència, el mutant Dgto1 creix amb dificultat en absència de treonina, serina o lisina. La manca de GTO1 en S. cerevisiae impedeix que utilitzi eficientment la cisteïna o la cistationina com úniques fonts de sofre, manifestant defectes en la transulfuració, procés que permet la síntesi de metionina a partir de cisteïna. Això suggereix que Gto1 podria estar regulant l'activitat cistationina b-liasa de Str3 mitjançant la seva activitat tiol oxidoreductasa, atès que Str3 també és peroxisomal. Atès que la cisteína 387 de Str3 és important per a la seva activitat biològica i està conservada en les cistationina b-liasas d'altres espècies de fongs, aquest residu podria ser diana de Gto1 per a la regulació de lestat redox de la proteïna Str3 RESÚMEN Saccharomyces cerevisiae posee dos glutatión transferasas (GST) denominadas Gtt1 y Gtt2 con capacidad de conjugar una molécula de glutatión con el sustrato estándar CDNB. Estas dos enzimas no son clasificables dentro de las clases convencionales descritas con base en la estructura de las GST de eucariotas superiores, aunque guardan cierta similitud estructural con las de clase Zeta. En esta memoria se describe la caracterización de tres GST de clase Omega en S. cerevisiae denominadas Gto1, Gto2 y Gto3, codificadas por las ORF YGR154c, YKR076w y YMR251w. Las enzimas de esta clase no tienen actividad sobre CDNB, pero son activas como tiol oxidoreductasa y poseen actividad dehidroascorbato reductasa y dimetilarsenato reductasa. La primera de ellas, Gto1, es peroxisomal y posee una señal de localización de tipo PTS1 en la región C-terminal. Dicha señal es reconocida por el transportador peroxisomal Pex5, que facilita su internalización en este organelo. Por otra parte, Gto2 y Gto3 tienen localización citoplásmica. Los genes GTO de S. cerevisiae se inducen por estrés oxidativo pero con patrones distintos para los tres genes. La dependencia de esta expresión de los factores de trascripción Yap1, Msn2 y Msn4 se relaciona con la presencia de secuencias YRE y STRE en los promotores de dichos genes. El mutante Dgto1 es sensible al agente oxidante diamida y tiene una concentración intracelular de glutatión menor que la cepa silvestre. Este fenotipo se relaciona con que el triple mutante Dgtt1 Dgtt2 Dgto1 sea sensible al cadmio, indicando que las tres GST Gtt1, Gtt2 y Gto1 intervienen en la detoxificación de este metal. Otro fenotipo relevante es la dificultad del mutante Dgto1 para crecer en medios con ácido oleico como única fuente de carbono, indicando que las funciones peroxisomales en dicho mutante están afectadas. La ausencia de GTO1 en S. cerevisiae causa así mismo el descenso en la expresión de varios genes involucrados en la vía de síntesis de cisteína y metionina. Como consecuencia, el mutante Dgto1 crece con dificultad en ausencia de treonina, serina o lisina. La ausencia de Gto1 en S. cerevisiae impide que utilice eficientemente la cisteína o la cistationina como únicas fuentes de azufre, manifestando defectos en la transulfuración, proceso que permite la síntesis de metionina a partir de cisteína. Ello sugiere que Gto1 podría estar regulando la actividad cistationina b-liasa de Str3 mediante su actividad tiol oxidoreductasa, dado que Str3 también es peroxisomal. Dado que la cisteína 387 de Str3 es importante para su actividad biológica y está conservada en las cistationina b-liasas de otras especies de hongos, este residuo podría ser diana de Gto1 para la regulación del estado redox de la proteína Str3. SUMARY SUMMARY Saccharomyces cerevisiae contains two glutathion transferases (GST) named Gtt1 and Gtt2, which are enzymes with glutathione conjugating activity with the standard substrate CDNB. These two enzymes are not classified into the conventional classes that have been established based on the structure of mammalian GST, although they keep certain structural similarity with Zeta class members. In this report, we describe the characterization of three S. cerevisiae Omega class GST named Gto1, Gto2 and Gto3, coded by ORFs YGR154c, YKR076w and YMR251w, respectively. The enzymes of this class do not exhibit activity with CDNB but they are active as tiol oxidoreductases, dehydroascorbate reductases and dimetilarsonate reductases. The first of them, Gto1, is located at the peroxisome and is targeted to this organelle throught a C-terminal PTS1-type sequence. This sequence is recognized by the peroxisomal transporter Pex5 that facilitates peroxisomal import. On the other hand, Gto2 and Gto3 are at the cytosol. The GTO genes of S. cerevisiae are induced by oxidative stress, although the expression patterns are different for the three genes. The expression of GTO genes depends on Yap1, Msn2 and Msn4 transcription factors and correlates with the presence of YRE and STRE sequences in the promoters of these genes. The absence of GTO1 causes a hipersensitivity to the oxidant diamide in S. cerevisiae and reduces the intracelular concentration of glutathione, compared with the wild type stain. This phenotype is related to cadmium sensitivity of the Dgtt1 Dgtt2 Dgto1 triple mutant, indicating that Gtt1, Gtt2 and Gto1 participate in the response to cadmium toxicity. Another rellevant phenotype of S. cerevisiae cells lacking GTO1 is the growth defect with oleic acid as the sole carbon source, indicating that the peroxisome funtions are affected in the mutant. This mutant also grows defficiently in the absence of threonine, serine or lysine in the growth medium. Lack of GTO1 function also affects negatively the expression of several genes involved in methionine and cisteine sinthesis. As a consecuence, the Dgto1 mutant shows defective growth in a medium with cisteine or cistationine as the sole sulfur source as a consequence of defective trasulfuration, a process that allows methionine synthesis from cisteine. This suggests that Gto1 could regulate the cystathionine b-lyase activity of Str3 through its thiol oxidoreductase activity, since Str3 is also peroxisomal. As the cysteine 387 residue of Str3 is important for the biological activity of this protein and is conserved in fungal species, this residue could be a target of Gto1 for the regulation of the redox state of Str3.