Caracterización y separación de flavonoides

Laburpena

El objetivo general de esta tesis ha sido caracterizar y separar flavonoides, sustancias cuyas propiedades antioxidantes despiertan un gran interés en la sociedad, mediante técnicas analíticas. Para ello, se han planteado unos objetivos específicos que implican la caracterización de flavonoides mediante la determinación potenciométrica de sus valores de constante de disociación ácida (pKa) y la separación de mezclas de flavonoides por cromatografía de líquidos (HPLC) y por cromatografía electrocinética micelar (MEKC). A raíz del estudio del comportamiento de los flavonoides en MEKC utilizando micelas mixtas como fase pseudoestacionaria, ha surgido la necesidad de desarrollar modelos que contemplen las interacciones de los solutos con la fase micelar. Por lo tanto, como objetivo adicional se ha planteado el estudio de la formación de micelas mixtas que forman la fase pseudoestacionaria en MEKC. Se han determinado los valores de pKa de catequina y epicatequina, flavonoides solubles en agua, potenciométricamente mediante la metodología Sirius. Se han detectado tres valores de pKa, dos muy cercanos entre ellos y un tercero más alto. También, se han evaluado y utilizado dos aproximaciones para estimar los valores de pKa acuosos de flavonoles poco solubles en agua (morina, fisetina y quercetina) a partir de sus valores de pKa en mezclas metanol (MeOH)/agua obtenidos por potenciometría. Las dos aproximaciones llegan a resultados similares, aunque una de ellas requiere solamente un valor de pKa en una única mezcla MeOH/agua, mientras que la otra (el clásico gráfico de Yasuda-Shedlovsky) necesita varios datos de pKa a diferentes mezclas MeOH/agua. Por esta razón, la primera aproximación es la recomendada para la estimación de los valores de pKa de flavonoides porque es más sencilla y rápida. Las diferencias de polaridad entre las diferentes familias de flavonoides estudiadas, y en algunos casos entre los solutos dentro de una misma familia, han obligado a desarrollar un método en gradiente para conseguir su separación cromatográfica en un tiempo de análisis razonable. El método HPLC que utiliza la columna monolítica ha sido aplicado a la identificación y cuantificación de flavonoides de cuatro familias diferentes en muestras de té verde, vino tinto, naranja, Ginkgo biloba y propóleo. El contenido de flavonoides obtenido para cada una de las muestras estudiadas, se ha comparado con los datos publicados en la literatura concluyendo que el método propuesto puede ser empleado para identificar y cuantificar los flavonoides más comunes en alimentos. A pesar de la gran variabilidad observada al aplicar el método de determinación de flavonoides en zanahorias, los resultados muestran valores de RSD inferiores a los publicados en la literatura. En cualquier caso, estos amplios márgenes de variabilidad parecen estar estrechamente relacionados con la función de los flavonoides en plantas. Únicamente el flavonoide epigalocatequina se ha determinado en mayor concentración en muestras de zanahoria cultivadas ecológicamente en las dos zonas de estudio. La separación electroforética de los flavonoides se ha optimizado mediante la variación conjunta del pH de la fase móvil y de la composición de la fase pseudoestacionaria, formada por micelas mixtas de dodecilsulfato de sodio (SDS) y colato de sodio (SC). Se han observado diferencias en la selectividad al ir de un sistema micelar de un componente SDS o SC a un sistema micelar mixto SDS/SC y también al variar el pH del sistema debido a las interacciones electrostáticas de los flavonoides con los diferentes tipos de micelas. El sistema MEKC de pH 8, 60/40 SDS/SC ha sido el que ha presentado la mayor resolución entre picos consecutivos y el menor tiempo de análisis, resultando este método competitivo frente al cromatográfico que emplea la columna monolítica para separar los mismos once flavonoides de cuatro familias diferentes. Se ha propuesto un modelo para la formación de micelas mixtas SDS/SC a partir del modelo del factor de retención en MEKC mediante el que se han calculado la proporción de cada surfactante en las micelas mixtas (70 % de SDS y 30 % de SC) y su constante de formación (ß~20). Además, también se ha demostrado que las propiedades de retención en la micela mixta son más parecidas a las de las micelas de SC que a las de las micelas de SDS.