Biophysical Studies of the C-terminal domains of the melibiose transporter from Escherichia coli

Zusammenfassung

En este trabajo, el objetivo principal ha sido el estudio del mecanismo del co-transporte de la permeasa de melibiosa (MelB) de Escherichia coli. Este proteina de membrana realiza co-transporte activo de varios oligosacáridos utilizando la fuerza electroquímica de cationes. Una característica remarcable de este transportador es el hecho que permite utilizar tres diferentes cationes, el protón, el sodio y el litio. Los sustratos con mayor afinidad a la proteína son el sodio y la melibiosa. Para cumplir nuestro objetivo principal se llevó a cabo el estudio de los dominios C-terminales de la proteína reconstituida como proteoliposomas. El bucle existente entre las hélices 10 y 11 así como la hélice XI del transportador se revelaron como dominios fundamentales para el funcionamiento del transporte activo. Estudios previos indican que la substitución de diversos amino ácidos por una cisteína impide el transporte. Con la técnica de mutagénesis dirigida se obtuvieron substituciones de amino ácidos en la proteína MelB, generando así múltiples mutantes con diferentes propiedades de unión, de translocación y de liberación de los sustratos. La solubilizacion de los mutantes generados se realizó con los detergentes LAPAO y DDM. Después de varios pasos de purificación, los mutantes de la MelB se reconstituyeron en liposomas de Escherichia coli para simular así el hábitat natural del transportador. Con técnicas espectroscópicas (infrarrojo y fluorescencia) se analizaron la unión de diferentes mutantes de MelB a los sustratos. Este estudio puso de manifiesto el papel crucial del amino ácido Lys-377 en el transportador MelB. Substituciones de dicho amino ácido por cisteína, valina, histidina, arginina y ácido aspártico mostraron como el transportador perdía completamente la unión a sodio y pasaba a acoplar el azúcar sólo en presencia del protón pero de manera disminuida. La carga en posición 377 de la MelB destaca por mantener el acoplamiento a los sustratos. Otra característica importante de la MelB es el volumen de cadena lateral que influye en la unión a sodio y melibiosa. La búsqueda de revertantes se realizó a través de un fenotipo diferente de la cepa, haciéndola crecer en placas de agar suplementadas de melibiosa. Los mutantes con un defecto de transporte, como es el caso de los mutantes de Lys-377, eran reconocidos al formar éstos colonias blancas, a diferencia de los revertantes, que generaban colonias rojas, indicando este color un pH dentro de la célula distinto en ambos casos. El cambio rojo en los revertantes es debido a la hidrólisis de la melibiosa en dos monosacáridos, glucosa y galactosa. La hidrólisis disminuye el pH que es detectado por el indicador suplementado en la placa. La secuenciación de estas subcolonias rojas reveló substituciones de los amino ácidos Ile-22 por serina y Leu-236 por fenilalanina. La mutación I22S ocurre en todos mutantes singulares de Lys-377, pero el desplazamiento de Leu-236 por fenialalanina sólo se detectó en el mutante K377R. Ninguno de los revertantes de K377/I22S recuperó la unión al azúcar en proteoliposomas y únicamente K377C/I22S fue capaz de unir el sodio pero con una afinidad menor. Los espectros de absorbancia de los revertantes indicaron que existe una cierta correlación entre cambios conformacionales de la MelB y la ausencia de señales en espectros de diferencia provocada por sodio. Como controles se usaron los mutantes singulares I22S y I22A que como revelan los espectros de diferencia, mantienen la capacidad de unión a el sodio pero no al azúcar. La isoleucina en posición 22 podría formar parte del sitio de unión de la melibiosa en MelB. Solubilizando el revertante K377R/L236F con LAPAO, detergente común para la purificación de MelB, demostró que dicho mutante tiene una afinidad disminuida a sus sustratos, tal y como demuestran los espectros de diferencia y fluorescencia. Sin embargo, las vesículas del mutante K377R/L236F tienen la capacidad de unir un análogo fluorescente de azúcar similar al C-less, la wild-type permeasa sin cisteínas. La solubilización del mutante con DDM unía los sustratos con mucha más afinidad que el mismo mutante solubilizado con LAPAO y mantienía la estructura similar a C-less. La prueba con K377C/L236F, un doble mutante generado por PCR, no reveló interacciones con los sustratos. Este resultado indica la importancia de la carga positiva conservada de la arginina en combinación con cambios estructurales para mantener la capacidad de unión de los sustratos. En la segunda parte se examinaron mutaciones con cisteínas de varios amino acidos cargados colocados en el bucle entre las hélices transmembranales X y XI. Estudios previos del transporte activo indican que tres amino ácidos perdían la capacidad de acumular melibiosa contra el gradiente. Los residuos Asp-351, Asp-354 y Arg-363 estudiados a través de IRdiff y fluorescencia, demuestraron la persistencia de unión a sodio aunque reducida. Los tres mutantes de MelB unían el azúcar también pero de una forma drásticamente reducida. Sólo en un revertante se descubrió un desplazamiento también en Ile-22 por una serina como en el caso de Lys-377. El revertante D354C/I22S demostró un incremento de la unión a sodio, pero una pérdida total de la unión a melibiosa. En el parte final de la tesis, se generaron ocho mutantes. Cada mutante con una mutación en un amino ácido diferente colocados todos ellos en la hélice XI de la MelB. Q372C, G379C, F385C, L391C y G395C mantuvieron la unión de sodio de manera equivalente a C-less. A383C y Y396C mostraron una cierta reducción de la señal mediada por sodio. El mutante G379V fue el único mutante que perdió totalmente la interacción con el catión. Los espectros de IRdiff inducido por melibiosa demostraron en A383C, L391C y Y396C una afinidad muy baja al azúcar. G379V tampoco fue capaz de unir la melibiosa.