Estudi de la implicació de la proteïna quinasa CK2 en via de senyalització de les auxines en arabidopsis thaliana

Resumen

Aquesta tesi s’emmarca dins d’un projecte d’investigació més general que té per objectiu caracteritzar i estudiar la funció de la proteïna quinasa CK2 de sistemes vegetals. La CK2 és una Ser/Thr quinasa present a tots els eucariotes estudiats fins al moment. Estudis fets en diversos eucariotes han evidenciat la importància d’aquesta quinasa en el creixement i en el control del cicle cel·lular, no obstant, les vies de senyalització en que participa aquesta quinasa encara no estan caracteritzades per complet. Al primer capítol d’aquesta tesi es descriu per primera vegada la involucració de la proteïna quinasa CK2 d’Arabidopsis en la via de senyalització de les auxines, en particular, del transport d’auxina. En plantes, la fitohormona auxina és la principal reguladora del creixement cel·lular. Recentment s’ha demostrat que la distribució asimètrica de l’auxina en els diferents òrgans de la planta és essencial per al desenvolupament vegetal i, aquesta distribució depèn principalment del transport polar de l’auxina. Per dur a terme aquesta investigació hem utilitzat un mutant dominant negatiu de la proteïna quinasa CK2 d’Arabidopsis thaliana (la línia CK2mut); aquest mutant té uns trets fenotípics que estan lligats a alteracions en processos dependents d’auxina, com són la inhibició del creixement de l’arrel principal, l’absència d’arrels laterals i el fenotip wavy. No obstant, s’ha comprovat que la percepció de l’auxina no està afectada ja que les plantes CK2mut responen al tractament exogen amb aquesta hormona. Hem demostrat que aquest mutant no té defectes en la síntesi de l’auxina, però si en el transport d’aquesta hormona. Eliminant l’activitat CK2 utilitzant eines genètiques (línia CK2mut) i eines farmacològiques (tractament amb TBB, un inhibidor específic de la CK2) hem demostrat que hi ha anomalies en la formació dels gradients d’auxina i canvis en l’expressió de gens relacionats amb les auxines; en particular, en membres de la família de transportadors de sortida d’aquesta hormona cap a l’exterior cel·lular (PINs) i en la proteïna quinasa PINOID (PID). Aquestes proteïnes són reguladores dels fluxos d’auxina. Estudis fets amb plàntules PIN4::PIN4-GFP i PIN7::PIN7-GFP han permès detectar que l’eliminació de l’activitat CK2 provoca l’acumulació d’aquestes proteïnes en vesícules endosomals. La formació de vesícules endosomals va fer pensar que la CK2 tenia algun paper en la via de tràfic vesicular d’aquests transportadors, i aquest ha estat el tema d’estudi del segon capítol d’aquesta tesi. S’han emprat diversos inhibidors de diferents punts de la via de tràfic vesicular per tal de poder discriminar a quin punt d’aquesta via actua la CK2. Aquests experiments s’han realitzat utilitzant plantes PIN7::PIN7-GFP i utilitzant com a model les plantes PIN1::PIN1-GFP, ja que PIN1 és el transportador d’auxina més ben caracteritzat. Amb el tractament amb tyrphostin A23 hem observat que les vesícules endosomals que es formen per eliminació de l’activitat CK2 estan revestides de clatrina. Amb els tractaments amb brefeldin A (BFA) i wortmannin hem determinat que la CK2 actua en algun punt de la via d’endocitosi diferent al d’aquests inhibidors. S’ha detectat que aquests endosomes no es tenyeixen amb el colorant específic de lípids FM4-64 i que són més grans que els endosomes obtinguts pel tractament amb BFA. Per últim, el tractament amb cicloheximida ens ha permès observar dos efectes: el primer és que la formació d’endosomes no depèn de la síntesi de proteïnes de novo i el segon, és que la inhibició de la CK2 no compromet la degradació al vacúol d’aquestes proteïnes. Així doncs, amb els resultats obtinguts podria ser que l’eliminació de la CK2 provoqués la formació d’endosomes sorting nexin aberrants, indicant així, que aquesta quinasa estaria intervenint en la via del retròmer.