Nuevos grupos de arqueas y bacterias halófilasFilogenómica y taxonomía molecular
- Infante Domínguez, Carmen
- Cristina Sánchez-Porro Álvarez Director/a
- Antonio Ventosa Ucero Director/a
Universidad de defensa: Universidad de Sevilla
Fecha de defensa: 16 de diciembre de 2015
- Jorge Lalucat Jo Presidente/a
- Rafael Ruiz de la Haba Secretario/a
- Martha Estela Trujillo Toledo Vocal
- David Ruiz Arahal Vocal
- Robertson Thane Papke Vocal
Tipo: Tesis
Resumen
Nuevos grupos de arqueas y bacterias halófilas. Filogenómica y taxonomía molecular Entre los ambientes hipersalinos, los habitats acuáticos son los que se han estudiado en mayor profundidad y se definen como aquellos ambientes que tienen concentraciones de sales más elevadas que las del agua del mar, es decir, superiores a un 3,5 % (p/v) de sales totales. Entre estos ambientes se encuentran las salinas de estanque múltiple, que presentan una amplia gama de salinidades, desde la del agua del mar hasta la saturación de sales, por lo que representan una excelente herramienta para estudiar el efecto de las sales sobre las poblaciones microbianas que se desarrollan en ellas (Pedrós-Alió y col., 2000). Los recientes estudios moleculares independientes de cultivo realizados en las salinas han puesto de manifiesto que una gran parte de la microbiota presente en las mismas no se corresponde con las especies aisladas y caracterizadas hasta la fecha. En el análisis de diversos metagenomas obtenidos de las salinas ¿Bras del Port¿ en distintos estanques a salinidades del 19 % y al 33% (SS19 Y SS33 respectivamente) se ha visto que la diversidad microbiana disminuye a lo largo del gradiente de salinidad (Fernández y col., 2014a). El número de secuencias relacionadas con el dominio Bacteria, tanto clasificadas como no clasificadas, disminuye con el aumento de la salinidad, siendo desplazado por secuencias relacionadas con el dominio Archaea. Los organismos más abundantes en los estanques de mayor salinidad son Haloquadratum walsbyi y representantes de los géneros Salinibacter y Halorubrum. Sin embargo en el estudio realizado por Fernández y col. (2014b) a partir de un metagenoma (IC21) obtenido de un estanque de una salina en Isla Cristina con un 21% de sales se observó en primer lugar, que la comunidad bacteriana disminuye bruscamente del 19 al 21 % de sales, siendo desplazada en IC21 por la comunidad de arqueas, es decir la estructura de la comunidad se simplifica a medida que aumenta la salinidad, incrementándose significativamente la presencia de Euryarcheota. A nivel de género en la base de datos IC21, los géneros predominantes del phylum Euryarcheota son Halorubrum, Haloquadratum y Natronomonas, como también lo son en las bases de datos al SS19 y SS33. El género Salinibacter (Bacteroidetes) es el siguiente mayor representado en los estanques de la salina «Bras del Port» de Santa Pola (Alicante). Los géneros predominantes del phylum Bacteroidetes difieren en las bases de datos estudiadas: en IC21 predomina Psychroflexus, seguido de Owenweeksia, Gracilimonas y Salinibacter. Con respecto a los géneros de la clase Gammaproteobacteria, los organismos predominantes pertenecen a Arhodomonas y al nuevo género Spiribacter. El objetivo principal de este trabajo ha sido aislar los grupos mayoritarios de arqueas y bacterias que han puesto de manifiesto los estudios metagenómicos. Para aislar estos microorganismos se han realizado muestreos en diferentes hábitats: en las salinas Bras del Port, de Santa Pola (Alicante), Isla Bacuta, Aragonesas e Isla Cristina (Huelva), en una salina del desierto de Namibia (África) y Cabo Rojo (Puerto Rico). Para abordar este objetivo se diseñaron diferentes medios de cultivos, con diferentes componentes y utilizando diferentes condiciones de incubación. Para el aislamiento de estos microrganismos se emplearon técnicas clásicas de cultivo. Se aislaron 1238 cepas a las que se le realizó un estudio filogenético basado en el gen ARNr 16S. Los resultados filogenéticos revelaron que 396 cepas eran haloarqueas y 842 cepas bacterias. La mayor parte de las bacterias aisladas pertenecían a los géneros; Halomonas y Marinobacter, seguidos de Salicola, mientras que en arqueas la mayor parte de las cepas aisladas pertenecían al género Halorubrum. Estos resultados se compararon con los estudios metagenómicos y se observó que los géneros predominantes eran diferentes entre dichos estudios y los aislados en el laboratorio. Sin embargo un género de la clase Halobacteria si coincidió en los dos casos, este género fue Halorubrum. Tanto los estudios metagenomicos previos como en nuestro estudio, se observó una gran abundancia de cepas o secuencias pertenecientes a este género, especialmente a partir de estanques de salinidades intermedias. En esta Tesis Doctoral hemos abordado un estudio detallado de estos aislados que nos ha permitido realizar una caracterización completa de aquellas arqueas y bacterias que presentaban bajos valores de semejanza (ARNr 16S) con respecto a las especies descritas previamente. Estos estudios basados en una aproximación polifásica, que incluye la caracterización filogenética, fenotípica, genotípica y quimiotaxonómica y filogenética, han permitido la descripción de cuatro nuevas especies; 2 bacterias: Fodinicurvata halophila y Aquisalimonas lutea y 2 arqueas: Halovenus salina y Halorubrum grantii. Para completar el estudio polifásico y poder analizar con más profundidad estos microorganismos se seleccionaron algunas de estas nuevas cepas para secuenciar sus genomas. Por un lado se secuenció el genoma completo de Aquisalimonas lutea y de las otras dos especies que constituyen el género Aquisalimonas. De esta forma pudimos completar los estudios taxonómicos moleculares mediante la determinación de parámetros como son el ANI (average nucleotide identity) y GGDC (Genome-to-Genome Distance Calculator). También se realizó los alineamientos de secuencias y la búsqueda exhaustiva de genes fundamentales para estos microorganismos. Los resultados genómicos nos ha permitido conocer de forma más detallada la disposición de sus genes, los genes que comparten con las especies más cercanas filogenéticamente y la clasificación de los mismos según sus funciones e incluso analizar las islas genómicas. Por otro lado, el estudio del genoma Halorubrum grantii nos ha permitido determinar que esta cepa es muy abundante en IC21. También se ha estudiado con detalle genes que se encuentran implicados en la producción de bacteriorodopsinas, de solutos compatibles (como son glicina-betaina), genes fotosintéticos y genes implicados en el ciclo del nitrógeno, del fosforo y en la degradación del glicerol. Debido a que el género Halorubrum es muy abundante en las salinas de estanques intermedios resultó interesante desarrollar un estudio más detallado de este género. En este estudio se incluyeron 15 genomas de Halorubrum disponibles en la base de datos NCBI y 4 genomas que correspondían a cepas aisladas de diferentes lugares relacionada con la especie Halorubrum chaoviator. Para la clasificación filogenética de estos microorganismos se utilizó un análisis por secuenciación multilócica MLSA. El MLSA se propone en sustituir como marcador filogenético al gen ARNr 16S. El MLSA utiliza genes altamente conservados de una única copia en el genoma y a diferencia del ARNr 16S no utiliza un solo marcador filogenético sino que utiliza 5 genes concatenados. Esto ha sido un avance importante en Haloarqueas, ya que estas son conocidas por su recombinación frecuente a través de grandes distancias genéticas (Williams et al, 2012;. Nelson-Sathi et al, 2012;.. Demaere et al, 2013) y la dependencia de un único marcador genético puede conducir a filogenias erróneas y por tanto, una mala clasificación taxonómica. El resultado de este estudio clasificó a las cepas de Halorubrum en dos grupos. El grupo 1 lo comprendían cepas relacionadas con Halorubrum chaoviator y Halorubrum ezzemoulense y el grupo 2 lo formaban cepas que apuntaban a ser un grupo nuevo. Los resultados filogenéticos estuvieron en concordancia con los valores calculados de ANI, GGDC e hibridación ADN-ADN. Pero además, este análisis detallado del género Halorubrum permitió observar dos sinonimias importantes entre las especies ya descritas, por una parte entre los genomas Hrr. chaoviator y Hrr. ezzemoulense y por otra entre los genomas Hrr. arcis, Hrr. litoreum, Hrr. distributum y Hrr. terrestre. En ambas casos los valores de ANI y GGDC fueron altos, por lo que apuntaban a ser una misma especie, además el caso de Hrr. chaoviator y Hrr. ezzemoulense dieron valores de hibridación ADN-ADN también muy altos. Para demostrar estas sinonimias se realizaron estudios aplicando diferentes técnicas genómicas: diagrama de Venn, sintenías y alineamientos. En todos los casos estos resultados mostraron que los genomas compartían más del 80 % de los genes totales anotados, además la sintenia estaba muy conservaba entre los genomas. Por lo tanto, estos estudios preliminares genómicos apoyaban la hipótesis de la posible nueva reclasificación del género Halorubrum. Bibliografía Casamayor, E. O., Massana, R., Benlloch, S., Ovreas, L., Diez, B., Goddard. V. J., Gasol. J. M., Joint, I., Rodríguez-Valera, F., Pedros-Alio, C. (2002) Changes in archaeal, bacterial and eukaryal assemblages along a salinity gradient by comparison of genetic fingerprinting methods in a multipond solar saltern. Environ Microbiol 4, 338¿348. DeMaere, M.Z., Williams, T.J., Allen, M.A., Brown, M.V., Gibson, J.A., Rich, J., Lauro, F.M., Dyall-Smith, M., Davenport, K.W., Woyke, T., Kyrpides, N.C., Tringe, S.G., Cavicchioli, R. (2013) High level of intergenera gene exchange shapes the evolution of haloarchaea in an isolated Antarctic lake. Proc Natl Acad Sci U S A., 110(42), 16939-16944. Fernández, A.B., Ghai, R., Martin-Cuadrado, A.B., Sánchez-Porro, C., Rodriguez-Valera, F., Ventosa, A. (2014a) Prokaryotic taxonomic and metabolic diversity of an intermediate salinity hypersaline habitat assessed by metagenomics. FEMS Microbiol Ecol 88, 623¿635. Fernández, A. B., Vera-Gargallo, B., Sánchez-Porro, C., Ghai, R., Papke, R. T., Rodríguez-Valera, F., Ventosa, A. (2014b) Comparison of prokaryotic community structure from Mediterranean and Atlantic saltern concentrator ponds by a metagenomic approach. Front Microbiol 5, 196. Nelson-Sathi, S., Dagan, T., Landan, G., Janssen, A., Steel, M., M