Transformació i metabolisme de fàrmacs al medi aquàtic mitjançant l’espectrometria de masses d'alta resolució

Resumen

En la sociedad actual, los productos farmacéuticos son imprescindibles para mejorar la calidad de vida de las personas. Estos son ampliamente consumidos para paliar dolencias y prevenir, combatir o curar enfermedades tanto para las personas como en veterinaria. Por lo tanto, la finalidad de los compuestos les propicia una actividad biológica inherente a su naturaleza y, en consecuencia, su destino ambiental genera una creciente preocupación por los efectos colaterales en los ecosistemas. Los fármacos están diseñados para ser consumidos, realizar su función y finalmente ser excretados. Su ratio de excreción y el de sus productos de transformación, llamados metabolitos, es diferente para cada principio activo. Este conjunto de compuestos, considerados contaminantes orgánicos, llega a través de las aguas residuales a las estaciones depuradoras (EDARs). Actualmente, las EDARs no están diseñadas para eliminar estos compuestos y por tanto en muchos casos pueden persistir durante el proceso de tratamiento. Como resultado de esta persistencia y pertinente entrada al medio acuático, se produce una exposición crónica de organismos a los contaminantes, los cuales pueden resultar afectados de distintas formas. Para agravar aún más la creciente contaminación, las aguas pluviales y de escorrentía pueden constituir un aporte adicional, ya que pueden provocar que estas aguas no reciban ningún tipo de tratamiento antes de entrar a los diferentes cursos de agua. Una vez en las aguas superficiales, el destino de los fármacos y sus metabolitos aún no está completamente estudiado. En la última década muchos estudios han determinado los diversos principios activos en los diferentes ecosistemas y han tratado de evaluar sus efectos. A pesar de estos esfuerzos, muchos estudios concluyen que para una evaluación más completa es necesario tener en cuenta las posibles transformaciones que sufren estos compuestos en el medio ambiente. Los productos resultantes son llamados productos de transformación (TPs) y pueden retener la actividad biológica del padre e incluso en ocasiones tener efectos toxicológicos superiores a los del compuesto original. En el desarrollo de ésta tesis se han estudiado las principales transformaciones de los fármacos en el medio acuático, incluyendo procesos bióticos y abióticos. Estos estudios se han realizado mediante metodologías basadas en la cromatografía de líquidos acoplada a la espectrometría de masas de alta resolución (LC-HRMS). En el capítulo 1 se ha revisado el estado actual de la LC-HRMS para diferentes aproximaciones en muestras ambientales. En la literatura se han reportado varias comparaciones con instrumentación de baja resolución (LRMS) y se puede constatar que actualmente, los espectrómetros de nueva generación, han superado las limitaciones tradicionales de esta técnica para el análisis cuantitativo, ofreciendo linealidades y sensibilidades similares a los instrumentos de triple cuadrupolo. Además, en los métodos multi-residuo a través de LC-HRMS, el aumento del número de compuestos objetivo no perjudica la sensibilidad. Evidentemente, las grandes prestaciones que nos ofrece esta técnica para la elucidación estructural de compuestos también la hace idónea para estos fines y se ha podido demostrar en los diferentes estudios realizados mediante la identificación de los TPs. Además, en los últimos años se han desarrollado nuevas estrategias mediante instrumentación HRMS híbrida, aprovechando la elevada resolución que ofrecen estos instrumentos, la correspondiente exactitud de masa y la adquisición selectiva o no selectiva de iones fragmento en una única inyección. Estos métodos permiten el análisis dirigido de compuestos conocidos, el barrido de compuestos sospechosos a partir de bases de datos e incluso el análisis no dirigido de compuestos desconocidos. Muchas de estas capacidades han sido utilizadas para detectar e identificar los TPS de los diferentes procesos estudiados en esta tesis. En el capítulo 3 se ha evaluado el efecto de la luz del sol sobre los fármacos, conocido como fotólisis, y que es considerado el principal mecanismo de transformación abiótico. De hecho, este puede ser el mecanismo de degradación más importante en ecosistemas con un gran impacto de la luz. En el capítulo 3 se ha evaluado las reacciones de foto-transformación de los inhibidores de la fosfodiesterasa V mediante simulaciones a escala laboratorio. Por este motivo se ha evaluado la fotólisis del principio activo más utilizado, el sildenafil (SDF). En los últimos años, este principio activo también ha sido muy falsificado, a través de análogos para adulterar productos naturales de venta por internet. La evaluación conjunta de las rutas de degradación nos ofrece más información sobre el efecto de la luz y las transformaciones producidas en su estructura. Mediante estos estudios se ha podido determinar un patrón de fragmentación común e identificar los TPS principales por los diferentes compuestos. Finalmente, para contrastar estas transformaciones en muestras reales, se han analizado muestras ambientales para detectar los TPS identificados. Este estudio ha significado la primera detección de dos TPS del SDF y / o de sus análogos al medio ambiente. En ecosistemas donde el efecto de la luz es menor, el principal destino y transformación de los fármacos viene marcado por los procesos de biodegradación causados por microorganismos. Para estudiar estos procesos, en el capítulo 3 también se muestra un estudio que se realizó a escala laboratorio donde se determinan los principales TPs por biodegradación de sulfonamidas. En esta ocasión la identificación de los TPs se utilizó para poder realizar un estudio cuantitativo de los mecanismos de resistencia bacteriana a las sulfonamidas. Los resultados constatan que a altas concentraciones el papel de la degradación de las sulfonamidas es más importante, mientras que a bajas concentraciones la adaptación de las bacterias mediante la propagación de genes resistentes a los antibióticos cobra protagonismo. Los TPs identificados muestran rutas diferentes a las observadas por los procesos abióticos, demostrando que en las aguas encontramos un cóctel de compuestos cuyos efectos son difícil de predecir. En la literatura se ha podido constatar que los fármacos han sido detectados también en la biota que está constantemente expuesta. En el capítulo 4 se ha querido evaluar esta exposición en diferentes organismos acuáticos y como estos se transforman a través de reacciones bioquímicas en diferentes TPs, generalmente conocidos como metabolitos. Por este motivo se han realizado de nuevo estudios a escala laboratorio para determinar los metabolitos principales. En primer lugar se han identificado los metabolitos del Ibuprofeno y la carbamazepina, dos fármacos habitualmente detectados en las aguas superficiales, mediante la inyección intraperitoneal a lenguados. La comparación de muestras control y muestras tratadas ha permitido detectar los nuevos picos correspondientes metabolitos. Mediante el estudio de los patrones de fragmentación de estos compuestos se han propuesto las identidades de los metabolitos. Esta aproximación ha permitido detectar e identificar tentativamente 13 metabolitos del ibuprofeno y 11 metabolitos de la carbamazepina en la bilis de los peces inyectados. A continuación mediante una nueva simulación en el laboratorio, se han identificado los metabolitos del ibuprofeno en plantas acuáticas, concretamente en lentejas de agua (Lemna gibba). En total se han identificado 11 metabolitos del ibuprofeno. Estos estudios han permitido demostrar la variabilidad en el metabolismo de un mismo fármaco en diferentes organismos acuáticos y como esto hace aún más compleja su evaluación, ya que un compuesto puede resultar casi inofensivo para una especie y muy tóxico por otro. Finalmente, aprovechando todos los conocimientos adquiridos en el desarrollo de esta tesis y las capacidades máximas de la LC-HRMS se ha estudiado el metabolismo de los fármacos en muestras salvajes. Para ello se ha realizado un muestreo de peces en el río Llobregat y se han analizado mediante un sistema Q-TOF. Inicialmente se ha realizado un barrido dirigido de más de 2000 contaminantes orgánicos. Esta base de datos había sido previamente generada mediante la inyección directa de patrones con el mismo método de análisis. Esto nos ha permitido detectar multitud de contaminantes, entre ellos más de 12 productos farmacéuticos de los 150 que contenía la lista. De los fármacos detectados se han seleccionado 6 fármacos que nos han despertado más interés, ya sea por su alta detección o para que sólo han sido detectados en un punto concreto del muestreo. Estos compuestos han sido el Ibuprofeno, el gemfibrozilo, pregabalina, la sertralina y la mepivacaina. A continuación, a través de un software de predicción de metabolitos y los conocimientos adquiridos en las simulaciones a escala laboratorio, se ha generado una base de datos de más de 150 metabolitos correspondientes a las transformaciones de estos seis fármacos. Con esta base de datos se ha realizado un barrido de sospechosos que ha permitido la detección de un gran número de candidatos. Mediante el estudio de los patrones de fragmentación, softwares de predicción de fragmentos y bibliotecas de espectros se han propuesto las estructuras de algunos de ellos con un buen grado de confianza (grado 2 de la escala propuesta por Shymanski y sus colaboradores).