Biodesign for conformational adaptability and guest recognition in crystalline frameworks

Resumen

La presente tesis doctoral ha sido realizada como compendio de publicaciones y lleva por título “Diseño y aplicaciones en redes metal-orgánicas de diseño biológico” (Design and Applications in Biologically Inspired Metal-Organic Frameworks). Se encuentra dividida en cuatro capítulos con unas conclusiones generales y resumen en castellano. El primer capítulo se trata de una introducción a las redes metal-orgánicas (MOFs) basados en materiales biológicos, tanto su diseño a partir de éstos, como algunas de sus aplicaciones más notables. Inicialmente se habla del origen de este tipo de sistemas, que radica en la de racionalización en la obtención de estructuras periódicas, siendo parte fundamental del desarrollo de la química supramolecular. Alrededor de esa fecha, muchos ya se dieron cuenta de que determinadas biomoléculas como los aminoácidos, péptidos, proteínas y nucleobases tenían potencial como ligandos, y de hecho existían varios ejemplos de incorporación a polímeros de coordinación. Siguiendo este orden, comenzamos la introducción hablando de cómo emplear componentes biológicos para el diseño de MOFs. Las primeras en ser nombradas son las nucleobases, de las cuales se han usado principalmente las bases púricas al ser las únicas con capacidad de conexión para la formación de redes. Éstas pueden proveer de uniones moleculares estables con cierta facilidad y varias posiciones para coordinar centros metálicos, teniendo cada una de esas bases una preferencia metálica única. Sin embargo, tienen muchas limitaciones al no ser elementos flexibles ni tener una capacidad elevada de post-funcionalización. A diferencia de éstas, los péptidos suponen una mejora en el aspecto de la variedad, abriendo un abanico de posibilidades al poder combinarse varios aminoácidos en una secuencia peptídica para formar la cadena de un MOF. Además, son ligandos orgánicos muy empleados y capaces de coordinar iones metálicos a través de sus grupos carboxilato y amino. La cadena lateral, al ser diferente en cada caso, puede impartir polaridad o apolaridad sobre el sistema del que forma parte. Finalmente se hayan las proteínas, el último escalón en complejidad, formadas por cadenas polipeptídicas asociadas de una forma predeterminada. La mayoría de las proteínas deben adoptar una conformación concreta, llamado plegado o estado nativo, para poder funcionar correctamente y desempeñar su función biológica. La energía necesaria para realizar ese plegado proviene principalmente de interaciones de van der Waals, enlaces por puente de hidrógeno y/o electrostáticas que suceden entre elementos de esa cadena peptídica. Estas interacciones también se hayan en los aminoácidos más superficiales y permiten la formación de redes, otorgándoles una estructura periódica y la posibilidad de formar cristales. Posteriormente, se desarrollan algunas de las aplicaciones más importantes de dichos sistemas, teniendo en cuenta que el diseño de los MOFs biológicos permite la implementación de grupos funcionales concretos en un material poroso así como controlar su distribución periódica en el espacio. De esta forma, se pueden diseñar entornos de poro a la carta a nivel molecular con funciones y geometrías específicas. Gracias a este alto nivel de control, los MOFs han sido estudiados para una gran variedad de aplicaciones entre las que se encuentran la catálisis heterogénea, separación, y aplicaciones biomédicas, entre otras. Sin embargo, cuando se aplican estos sistemas a campos relacionados con lo biológico, la toxicidad es uno de los puntos más importantes a considerar y hace al tipo de sistemas que tratamos más interesantes. El primer gran grupo de aplicaciones que saca partido de la funcionalización es el de la catálisis. Los catalizadores basados en bio-MOFs son especialmente interesantes ya que no solo tienen las características de estos materiales como la posibilidad de ser post-funcionalizados y la existencia de grupos catalíticos, sino que además son extremadamente robustos y eficientes. Además destacan por la presencia de una gran cantidad de metales, proporcionando un aumento en el número de sitios activos que se distribuyen homogéneamente en todo el material, dando lugar a una mejora en la actividad catalítica.. El segundo grupo es la separación, pues estos materiales pueden reconocer moléculas huésped de forma específica y son sencillos de diseñar. Los MOFs poseen una gran porosidad y área superficial, lo que, junto con la personalización del poro, la posibilidad de generar sitios de coordinación metálicos libres combinado con la distribución periódica de estos elementos, proporcionan una base modular para la separación de una gran variedad de compuestos. El tercer y último gran grupo se basa en el confinamiento de moléculas dentro de los poros. En esta parte nos centramos en la incorporación de enzimas al interior de los MOFs, al poder proporcionarles estabilidad y personalización a las proteínas huésped. Dentro del poro, las enzimas se hayan protegidas de toda interacción con el exterior que les pueda perjudicar, pudiendo seguir realizando su función. Durante este capítulo se ha tratado de recalcar por separado cada uno de los tres componentes fundamentales que definen a un MOF: bloque de construcción inorgánico (metal), orgánico (conector) y el poro resultante. Por ello, se ha dividido por nivel de complejidad biológica: nucleótidos, péptidos y enzimas; y también por aplicaciones principales de cada uno de ellos. Los nucleótidos se han empleado principalmente para catálisis al tener la mayoría de materiales posiciones vacantes en la esfera de coordinación del metal. Los péptidos, al ser quirales, han tenido mayor relevancia en el campo de la separación quiral. En el caso de las enzimas, se trata de usar MOFs como plataformas personalizables para estabilizarlas y mejorar su rango de actuación sin afectar a su función biológica. En el segundo capítulo se estudia la respuesta estructural a estrés por presión de un MOF compuesto por dipéptidos. Los dipéptidos ofrecen una gran versatilidad química a partir de la elección de combinaciones específicas de amino ácidos en su secuencia. Esta versatilidad química combinada con la flexibilidad conformacional del enlace peptídico pueden ser trasladadas al diseño de MOFs peptídicos. Es interesante estudiar cómo estos sistemas estructuralmente flexibles actúan frente a presión externa ya que, precisamente una de las desventajas que poseen, es que tienen propiedades mecánicas muy débiles pudiendo acabar en el colapso del poro o de la estructura una vez se le añade presión. Por tanto, este tipo de deformaciones estructurales también afectan a la función, pudiendo producir efectos no deseados. La flexibilidad estructural abre un abanico gigantesco de posibles respuestas a la presión, las cuales deben ser investigadas en detalle con el objetivo de predecirlas. Lamentablemente, no hay una gran cantidad de ejemplos de este tipo de estudios, ya que hasta la fecha se han basado en sistemas porosos. Estas estructuras al poder alojar en su interior moléculas de disolvente o huéspedes, no permiten saber si realmente lo que se mide es efecto elástico de la estructura o de una influencia externa. Por ese motivo, nosotros usamos un MOF “denso” sin porosidad accesible, Zn(GlyTyr)2, para el que la ausencia de moléculas de disolvente imposibilite la entrada de disolvente y ayude a simplificar el refinamiento de la difracción de rayos X bajo presión. Zn(GlyTyr)2 presenta una estructura laminar que se empaqueta en el estado sólido por interacciones entre las cadenas lateral de péptidos en capas vecinas. Pese a que se puede considerar no poroso, sigue siendo un material con un volumen de celda variable y su compresibilidad es mucho mayor que otros materiales basados en zeolitas. Con el objetivo de discernir qué técnicas y medio usar para los experimentos, primero debimos elegir qué medio emplear de entre los más usados medios transmisores de presión (Pressure Transmitting Medium) abreviado PTM, dentro de una celda de diamante (Diamond Anvil Cell) abreviado DAC. Esta técnica permite aplicar una presión constante y homogénea a todas las partes del cristal. Con el objetivo de permitir una recogida de datos lo más adecuada posible y evitar a la vez la amorfización de las muestras, decidimos empezar con experimentos de rayos X. Para conocer la presión de trabajo se empleó un cristal de rubí, y se comprobó que había una diferencia notable en las medidas a 3.7 GPa, atribuyéndose a una deterioración intrínseca de las condiciones quasi-hidrostáticas de los PTMs. La cristalinidad se pudo recuperar tras retirar la presión. Tras elegir al fluorinert y la mezcla metanol:agua como las que más respetaban la estructura, promoviendo una menor amorfización según aumentaba la presión, se comenzaron los experimentos bajo presión. Para los experimentos de rayos X bajo alta presión, las estructuras se fueron refinando conforme se incrementaba la temperatura, teniendo algunas limitaciones al recogerse únicamente un 30% de las reflexiones. La celda del DAC está cerrada por ambos lados para poder ejercer la presión de forma controlada, y la única parte donde se podía enfocar era por la delantera. Por este motivo, tuvimos que emplear refinamientos estructurales para ser capaces de llegar a estructuras que pudiéramos comparar. Los cambios estructurales que observamos mostraban un cambio sobre los 2 GPa, indicando una transición de fase isoestructural de segundo orden. El grupo espacial, sin embargo, no cambiaba con el incremento de presión y el volumen de la celda no mostraban ninguna discontinuidad. La información obtenida mostraba claramente que el sistema Zn(GlyTyr)2 poseía una elevada resistencia anisotrópica a la compresión. Los mayores cambios en la estructura los pudimos observar de 0 a 4 GPa, donde la transición de fase del sistema se lleva a cabo gracias a una reorganización de la esfera de coordinación de los centros de Zn(II). Este fenómeno es controlado mediante la coordinación del grupo carboxilato de la glicina, haciendo que el clúster metálico cambie de configuración geométrica. El cambio en la conectividad general del sistema se lleva a cabo por igual por todo el MOF, mediante la relajación de las capas internas de la estructura, dependiendo de ajustes en las interacciones supramoleculares en el péptido. Esta información señala que el responsable real de esta capacidad del MOF de comprimirse sin degradarse es debida a los aminoácidos en la cadena peptídica, pues son capaces de reducir la distancia del puente de H que separan las capas. El péptido es el responsable de los cambios cooperativos dentro del MOF, y concretamente, es la tirosina el aminoácido que más contribuye a esa relajación estructural y mantenimiento de la estructura. Como resumen se puede concluir que gracias al péptido junto con las interacciones no covalentes del MOF, éste puede soportar las presiones externas sin llegar a la amorfización. En el tercer capítulo seguimos explorando las posibilidades ofrecidas por los MOFs basados en péptidos, pero apuntando a sus posibilidades en procesos de reconocimiento molecular. Utilizamos el MOF Cu(GlyHisGly) para separar dos fármacos frecuentemente empleados como drogas recreacionales: metanfetamina (MA) y efedrina (EP). Ambos son compuestos quirales y a nivel farmacéutico es imprescindible su separación para poder ser empleados. Para poder saber si habrá una separación verdaderamente relevante, llevamos a cabo un estudio teórico de la respuesta a los enantiómeros mediante el programa Materials Studio R2 empleando simulaciones de Monte Carlo. Esta aproximación nos permitió comprender verdaderamente qué rol juega el péptido al establecer una interacción preferencial en el sito de adsorción más favorable. Los dos enantiómeros (+,-) de la MA y EP fueron introducidos en la estructura tras haberla vaciado de disolvente. Después procedimos a estudiar las condiciones más energéticamente favorables de EP y MA, haciendo girar las moléculas de forma aleatoria y aceptando la estructura resultante sólo si era más estable que el paso anterior. Aunque la precisión del método empleado no permite hacer una predicción cuantitativa de la selectividad quiral, la simulación consiguió aproximarnos las energías indicando que la separación más efectiva sería la de EP, como resultado de las interacciones supramoleculares cooperativas que lleva a cabo. La adsorción de la (+)-EP era pues preferencial y mucho mayor que en el caso de la (+)-MA, llegando a presentar diferencias energéticas cercanas a 13 kcal/mol. Viendo que estos resultados eran prometedores de por sí, tratamos de trasladar estas energías al plano experimental para probar las capacidades predictivas de nuestro método. La explicación de este buen resultado radica en la interconexión de los canales, la cual da lugar a una decoración de la superficie del espacio vacío con grupos carboxilatos, amida e imidazol apuntando al interior de los canales. Para realizar un primer estudio tentativo de las capacidades separativas de este MOF, comenzamos con una prueba de absorción simple en disolución. Es importante destacar que usualmente estos sistemas suelen evacuarse completamente de disolvente antes de realizar las pruebas, sin embargo, los MOFs constituidos de péptidos suelen poseer una baja estabilidad en ausencia de disolvente. Afortunadamente, el reconocimiento quiral es un proceso dinámico y la eliminación del disolvente ocupando los poros no es necesaria al ser sustituido por las moléculas a separar. Por tal motivo, nos abstuvimos de secar el MOF y se usó directamente tras un lavado para medir las retenciones. En esta primera prueba, decidimos simplemente calcular cuánto fármaco entraría dentro del MOF, midiendo el exceso enantiomérico en disolución tras un tiempo determinado. Por tanto, a una pequeña cantidad de MOF se le añadió fármaco en mezcla racémica y se midió el enriquecimiento de los enantiómeros a diferentes tiempos. Tras 1 hora en el caso de MA y 4 horas en el caso de EP se vio claramente que, mientras que la cantidad de (-)-MA y (-)-EP eran prácticamente la misma, la cantidad de (+)-MA y (+)-EP había sido reducida de manera notable. Atribuimos los largos tiempos de contacto a la composición polar de los disolventes. La retención preferencial se debe a que los fármacos quirales se estabilizan de forma diferente dentro del poro, concretamente se llega al máximo de retención que supone un 30% de exceso para la (+)-MA y 37% para la (+)-EP tras 4 y 2 horas, respectivamente. Los resultados del experimento coinciden perfectamente con las simulaciones teóricas que predicen esa diferenciación de los enantiómeros (+) en el poro quiral, ligado a las conformaciones específicas que las moléculas adoptan en el interior de los poros. Las simulaciones teóricas además predicen una separación más favorable de los enantiómeros de EP respecto a lo obtenido para la MA, y efectivamente son los resultados que muestran los experimentos. Lamentablemente, el uso de MOFs como fase estacionaria posee una gran variedad de limitaciones debido a su baja estabilidad y heterogeneidad de partículas. Esto limita en gran medida las fases móviles que pueden ser usadas con analitos polares, e incrementa la dificultad para la obtención de un empaquetado de las partículas dentro de la columna. Una falta de control sobre el tamaño y forma de los cristales de MOF puede dar lugar a mayores tiempos de retención, un rendimiento cromatográfico bajo y separaciones más largas. Por este motivo e inspirados por los buenos resultados hasta el momento, decidimos probar una de las separaciones más usadas en industria por su sencillez: extracción en fase sólida (solid-phase extraction) o SPE. A diferencia de las columnas usualmente más empleadas, las SPE permiten el aislamiento de los enantiómeros en lugar de una medición de la riqueza de la mezcla. El SPE permite obtener una medida cromatográfica mediante la eliminación de interferencias, además de un incremento en la concentración total y simplificación de la muestra. Empleamos esta técnica con el MOF como base en un cartucho de polipropileno de SPE y le hicimos pasar una disolución racémica de EP por el interior. En esta segunda parte decidimos concentrarnos en la EP y dejar de lado la MA ya que la primera nos dio mejor resultado en la prueba inicial, además de ser la que más sería retenida mediante la predicción teórica. En las pruebas que llevamos a cabo, la columna quiral permitió llegar a un 54% de separación del enantiómero (+)-EP a partir de dichas muestras equimolares en 4 minutos, con una precisión totalmente satisfactoria y tiempos de retención cortos. La valoración sobre la precisión de la separación es una relación entre la distancia entre los picos y la anchura de los mismos. Estos resultados sugieren que el sistema Cu(GlyHisGly) ofrece un alto rendimiento en términos de reconocimiento estereoselectivo y de eficiencia en tiempo, para una columna de separación quiral de alta velocidad. Para acabar, con el objetivo de actuar como test de que verdaderamente es el MOF el que está actuando para establecer la separación entre enantiómeros, se realizó la misma prueba inicial pero directamente con la mezcla de Cu(II) y GlyHisGly en la misma proporción en que estaba presente en el MOF. Tras observar una diferencia inexistente en término a separación enantiomérica, pudimos concluir que ésta estaba basada en la distribución periódica de los canales quirales de la estructura del MOF, y que ésta era clave a la hora de separar ambos enantiómeros. La esencia del trabajo radica en el potencial que posee la mezcla entre teoría y experimento, permitiendo realizar tareas predictivas para maximizar las separaciones. En el capítulo 4 se trata un tema completamente diferente. Este trabajo surge de la necesidad de idear un método de inmovilización de enzimas en MOFs capaz de vencer las restricciones impuestas por el elevado tamaño de estas biomoléculas y las aperturas de poro en el material poroso. Pese a que hay una gran cantidad de trabajos publicados sobre este tema, todos se centran en el contenedor y no en el contenido, modifican o alteran el MOF considerando a la enzima como un bloque inmóvil. Sin embargo, una de las propiedades más importantes de las enzimas y de la mayoría de las proteínas, es que tienen la capacidad de plegarse hacia su estructura terciaria sin ninguna asistencia. Este proceso se lleva a cabo mediante “saltos” energéticos, pues las enzimas siempre se pliegan hacia la formación energéticamente más favorable, y llegar a su estado nativo es un proceso de prueba-error a nivel de residuo. Basándonos en el único estudio donde esta peculiaridad se ha aprovechado para proteínas, decidimos llevarlo a un campo tan complejo como es el de las enzimas, tratando de usar un desenhebrado parcial para introducir la enzima dentro del poro del MOF. Al permitir que una enzima cupiera por la ventana de un poro donde normalmente sería incapaz de entrar abriría un nuevo abanico de posibles MOFs y enzimas a usar, eliminamos una de las restricciones más importantes de este tipo de técnicas. El proceso se inicia cuando la enzima lleva a cabo los cambios conformaciones bajo los cuales su estructura, y por tanto tamaño, van a variar permitiendo la migración a través de las ventanas del poro hacia la superficie del cristal. Empleando este proceso natural como concepto para desarrollar este nuevo tipo de inmovilización, decidimos atrapar a la enzima dentro del poro y provocar su replegado dentro de él, evitando su posterior salida. Usar enzimas obviamente supone un reto adicional, pues su estructura nativa es la que va a dar lugar a la función catalítica, por ello escogimos una familia de enzimas especialmente robusta y de tan solo una cadena. Se trata de una proteinasa aspártica de Aspergillus saitoi, la cual tiene propiedades biotecnológicas notables, habiendo sido estudiada previamente. Por otro lado, decidimos usar el poro del MIL-101(Al)-NH2, pues sus cavidades mesoporosas son de 3.6 y 2.9 nm con ventanas hexagonales y pentagonales de 1.6 y 1.2 nm respectivamente. Esos tamaños son compatibles con el diámetro de la enzima, con un ratio cerca del 1.2, dejando un cierto espacio para que la enzima pueda volver a su estructura nativa por sí misma. El tamaño de la enzima se calculó mediante el uso de Dynamic light scattering o DLS, un aparato capaz de medir el radio de objetos en disolución, captando un diámetro medio de 2.85 nm. Además, el MOF ya había sido previamente empleado en aplicaciones compatibles con las condiciones biológicas y se puede adaptar a los requerimientos de las enzimas. También se comprobó que el sistema era estable en el tampón empleado durante el proceso (TRIS) y se empleó la versión funcionalizada con aminos, ya que la dicha decoración del interior de los poros ofrece un ambiente de hidrofilicidad que promueve la formación de puentes de hidrógeno. El incremento en polaridad también aumentó la dispersibilidad del MOF en la disolución acuosa. Con el objetivo de permitir a la enzima entrar dentro de la estructura a través de esa desnaturalización parcial, pensamos en usar condiciones como un ligero incremento en la temperatura y el uso de un disolvente apolar. Estas son condiciones comúnmente empleadas con este propósito, ya que mediante ellas se puede reducir el efecto hidrofóbico e incrementar la energía cinética del sistema. La nueva disposición de péptidos con una estructura alterada, cambia de forma eficaz la distribución de energías asociadas con la selección de interacciones supramoleculares, con el disolvente y entre la proteína en si misma. Esto afecta a la estructura terciaria de la enzima. Para garantizar que toda la enzima se encuentra dentro del MOF, lavamos con detenimiento el sólido resultante del proceso, empleando buffer TRIS y midiendo en el UV-Vis hasta perderse la señal. Para poder entender qué le sucede exactamente a la enzima durante este proceso, empleamos simulaciones con dinámica molecular. Se realizaron 1.0 µs de simulación donde se permitió a la enzima interactuar en los tres medios que tratamos: buffer TRIS, hexano-buffer, y la mezcla de ambos. Mientras pasa el tiempo, y empleando un valor estándar para el tamaño de la proteína como es la desviación media cuadrática (root mean square deviation) o RMSD, concluimos que efectivamente hay un despliegue parcial. El RMSD continúa incrementando con el tiempo hasta llegar a valores mayores en hexano que en el medio polar, tanto a 25°C como 60°C. Estos datos confirman que la enzima es únicamente capaz de ese cambio estructural mediante la combinación de ambos parámetros durante el proceso de inmovilización. En una comparación de esta estructura con la nativa, se ve claramente que la proteína sufre un despliegue en el disolvente apolar, implicando la apertura de una hendidura entre las dos subunidades enzimáticas. De hecho, estas pruebas mostraron una transformación progresiva entre hélice alfa y hojas beta hacia regiones no estructuradas con un aumento progresivo hacia regiones sin estructurar, consistiendo en aminoácidos que no forman parte de una estructura secundaria definida. Los resultados obtenidos en las simulaciones confirman que en estas condiciones somos capaces de provocar a la enzima un despliegue parcial para prepararla para la posterior difusión al interior del MOF en dichas condiciones. Para apoyar estos cálculos, nos propusimos obtener resultados directos del estado de la enzima, empleando a tal efecto espectroscopía de fluorescencia. Esta técnica nos permite comparar los espectros de emisión de los tres estados: proteasa libre, proteasa en el medio de incubación y proteasa dentro del MOF. Esta proteína en particular consta de aminoácidos con fluorescencia como tirosina y triptófano, y por tanto podremos saber si ha habido algún cambio en su estructura siguiendo la señal que estos residuos proporcionan. Incubar la enzima en hexano provoca un desplazamiento de la señal hacia el rojo, que se asocia comúnmente a una desnaturalización proteica, correspondiente a un cambio en el entorno de los aminoácidos hacia lo apolar (siendo un cambio reversible). Por otro lado, cuando la proteína es introducida dentro del MOF hay un cambio diferente, llevando a un shift hacia el azul lo cual indicaría un cambio hacia la polaridad. Probablemente lo que ocurra es que al interaccionar con las cavidades del MOF, la enzima no esté verdaderamente plegada en su estructura nativa, sino en algo similar. Igualmente, la inmovilización de la enzima dio lugar a un incremento en su estabilidad, pudiéndose ver su inserción por TGA, Raman, Infrarrojo y experimentos de Adsorción. El MOF permaneció estable durante todo el proceso, sin variaciones notables en el tamaño de partícula. La parte final del trabajo consistía en corroborar si ese estado intermedio en el que se encontraba la enzima era funcional, llevándose a cabo experimentos de catálisis. La reacción que se siguió consiste en la rotura del enlace peptídico de Gly-Tyr, un sustrato que se puede medir en el UV-Vis con facilidad y puede entrar por las cavidades del MOF. Una primera tanda de medidas a condiciones óptimas para la enzima mostró que la enzima en disolución era más rápida que la que estaba dentro del MOF, explicándose ya que la velocidad de difusión del sustrato es mucho mayor estando fuera del composite. Sin embargo, cuando las condiciones fueron alejadas hacia extremos en pH y temperatura, la enzima inmovilizada mostró una notable estabilidad y eficiencia. En disolución, la enzima aguanta hasta los 55°C y pH 8 antes de perder toda actividad, mientras que la mezcla de MOF y enzima llega a 105°C y pH 12. Adicionalmente, se demostró dicho incremento en la actividad gracias a la unión, mediante el reciclaje y almacenaje a temperatura ambiente mostrando actividad tras 2 semanas y 5 ciclos de uso.