Aplicación de la embriogénesis somática y el "priming" para mejorar la tolerancia a phytophthora cinnamomi en quercus ilex l

Resumen

La encina (Quercus ilex L.) es una especie de gran importancia desde el punto de vista ecológico, económico y social en el ámbito mediterráneo. Junto al alcornoque (Quercus suber L.) está sufriendo en los últimos años un incremento de la mortalidad agravado por la sequía y las altas temperaturas provocadas por el cambio climático. Este decaimiento se ha observado desde la década de los 80 y, a principios de los 90, se demostró que estaba asociado al oomiceto Phytophthora cinnamomi, considerándose de entonces el principal agente causante de este decaimiento conocido como "la seca" de la encina. En este contexto se hace necesaria la implementación de nuevos métodos de protección de los bosques, aplicando herramientas biotecnológicas que permitan alcanzar los objetivos de los programas de prevención y restauración, de manera que la conservación de los ecosistemas de los que forma parte la encina sea posible. Este trabajo se ha realizado con el objetivo de desarrollar herramientas para generar genotipos de encina con mayor tolerancia al patógeno Phytophthora cinnamomi. El estudio se centra en la propagación de genotipos escape (tolerantes de manera natural al patógeno) mediante la embriogénesis somática (ES) y en la búsqueda de metodologías de elicitación de embriones somáticos de encina que permitan la inducción de memoria epigenética “priming”, sin afectar la integridad de las líneas embriogénicas. La técnica de “priming” permite que las plantas elicitadas sean capaces de responder más rápida o contundentemente al estrés biótico producido por la infección de P. cinnamomi. Esta capacidad de respuesta se transmite a las siguientes generaciones. Además, se ha tratado de identificar marcadores precoces de respuesta a estrés para seleccionar, en una fase inicial, la efectividad de los tratamientos de elicitación antes de que las plantas puedan ser testadas en campo. Se consideraron genotipos escape aquellos sin sintomatología y con presencia del oomiceto en el suelo y raicillas alrededor del árbol. La clonación de los genotipos se realizó a partir de los amentos de encina. Se determinó la capacidad embriogénica de 33 genotipos, 6 considerados escape y 27 sensibles a la infección por el oomiceto. Esta capacidad depende, en gran medida, del genotipo ensayado. Se establecieron 5 líneas embriogénicas, 4 de ellas provenientes de 2 genotipos escape (VA5 y H5). Es necesario optimizar las fases de germinación y aclimatación en encina. La elicitación durante periodos cortos de tiempo en medio líquido resultó menos lesiva que la elicitación durante periodos largos en medio sólido. La eficacia de los tratamientos se testó en primera instancia a través de cultivos duales embriones somáticos-patógeno y de la determinación de la producción de especies reactivas de oxígeno. En la línea Ha13 los resultados obtenidos, en base a la inhibición del crecimiento del micelio y producción de H2O2, sugirieron que 50 μM de MeJA durante 3 días en medio líquido era el tratamiento más efectivo para mejorar la respuesta a estrés. No obstante, otros elicitores como BABA y AS resultaron efectivos en la línea E00. Para identificar marcadores precoces de respuesta a estrés se llevaron a cabo análisis de expresión de genes implicados en esta respuesta, así como de la variación en los perfiles proteicos, fenólicos y hormonales. Finalmente se midieron las actividades enzimáticas catalasa, peroxidasa y el contenido en glutatión en muestras elicitadas y/o infectadas y sus controles. A pesar de la variabilidad observada en los diferentes análisis, debida fundamentalmente al efecto línea, se puede concluir que la elicitación provoca cambios en los niveles de expresión de genes implicados en la síntesis de fenoles, y en los perfiles proteicos, fenólicos y hormonales de las líneas embriogénicas antes y/o después de la infección con el oomiceto. La línea VA5 11f, generada a partir de un árbol escape, presentó, antes de la infección, niveles de expresión de CAD1Qs, ChSQs, PALQs y CsTL1 superiores a los de las otras dos líneas (Q8 y E00), generadas a partir de genotipos susceptibles. En Q8 y E00 se observaron incrementos en la expresión de CSQs, CAD1Qs y PALQs tras la infección con el oomiceto, corroborando la implicación de estos genes en la respuesta a estrés. La línea escape VA5 11f presentó un perfil fenólico muy diferente a las otras dos líneas, con un elevado contenido en ácido cafeico. Aunque la elicitación con MeJA50 no incrementó la expresión de los genes estudiados en las líneas Q8 y E00, sí se observó un incremento en los niveles de ácidos fenólicos (fundamentalmente ácido cafeico), así como del flavonol quercetina. Se puede concluir que el ácido cafeico es un marcador de tolerancia ante estrés inducido por la elicitación. La infección del material elicitado incrementó la expresión de los genes PALQs y CAD1Qs que codifican enzimas que catalizan los primeros pasos de las rutas de síntesis de compuestos fenólicos, indicando un reforzamiento de las respuestas a la infección debido a la elicitación. La elicitación aumentó la concentración de JA, y la posterior infección indujo un fuerte incremento del contenido de esta hormona en las muestras elicitadas. Esto demuestra que la elicitación potencia las rutas de señalización ante una posterior exposición al estrés. En el análisis del perfil proteico de la línea E00 se demostró que la infección del material elicitado también incrementa la expresión de proteínas implicadas en la detoxificación de ROS y en la síntesis de antocianos, así como la actividad peroxidasa. Los resultados indican que la elicitación con MeJA es un tratamiento adecuado para incrementar las defensas en las líneas embriogénicas de encina generadas a partir de genotipos susceptibles. Esta información ha de ser corroborada ex vitro mediante la infección de las plantas generadas y aclimatadas. El comportamiento de la línea VA5 11f en cuanto a su expresión génica, contenido en fenoles y actividad ROS propone marcadores de tolerancia que se han de comprobar testando la respuesta al oomiceto en raíces de plántulas generadas a partir de este material embriogénico.