Design of strategies for optimisation in liquid chromatography

Resumen

La cromatografía líquida de fase inversa (RPLC, reversed-phase liquid chromatography) es la técnica más utilizada para el análisis de compuestos orgánicos, en un amplio intervalo de estructuras e hidrofobicidades, debido a su versatilidad, robustez y sensibilidad. Sin embargo, la selectividad y el tiempo de análisis dependen de una forma compleja de varios factores experimentales que interaccionan entre sí, como son la concentración de disolvente orgánico, el pH y la temperatura. Debido a la dificultad en la búsqueda de las condiciones experimentales que permitan la separación simultánea de todos los compuestos en una muestra, las optimizaciones basadas en ensayo y error resultan muy laboriosas, y en ocasiones, no son satisfactorias. Además, no ofrecen garantías de conducir al verdadero óptimo. Las mejores condiciones de separación se deben hallar, preferiblemente, utilizando la información extraída de un conjunto reducido de experimentos cuidadosamente planificados, que cubran todo el espacio de interés para los factores experimentales. Los datos obtenidos se utilizan con el propósito de ajustar un modelo de retención para cada analito, que permita predecir los tiempos de retención para cualquier nueva condición arbitraria, dentro del dominio experimental, y simular cromatogramas. Ello permite, finalmente, seleccionar las mejores condiciones de separación mediante el uso de metodologías asistidas por ordenador, en las denominadas optimizaciones interpretativas. Los modelos ajustados también pueden proporcionar información sobre las interacciones establecidas dentro de la columna cromatográfica. El trabajo de Tesis Doctoral realizado incluye estudios fundamentales para mejorar las metodologías de optimización interpretativa y su aplicación al análisis de fluidos fisiológicos y productos naturales (hojas y pulpa de olivo, y hierbas medicinales). Se consideró la determinación de varios grupos de compuestos: alquilbencenos, sulfonamidas, antagonistas de los receptores β adrenérgicos, aminoácidos, fenoles y polifenoles, así como compuestos desconocidos en un amplio intervalo de polaridades contenidos en las hierbas medicinales analizadas. La mayoría de los análisis se realizaron con fases móviles de acetonitrilo-agua en elución isocrática y de gradiente, pero también se investigó el efecto de la presencia de equilibrios secundarios cuando se añade un tensioactivo a la fase móvil. A lo largo del trabajo, se desarrollaron nuevas estrategias y herramientas, algunas de ellas sin antecedentes previos, lo que requirió la construcción de software diverso. El rendimiento de los nuevos desarrollos se comparó, cuando fue posible, con otros publicados anteriormente. El trabajo efectuado durante la Tesis Doctoral aparece expuesto en la Memoria en dos grandes apartados, que recogen diversos desarrollos relacionados con: (i) el incremento de la capacidad de modelización en cromatografía líquida, y (ii) la mejora del rendimiento en la separación de los picos en huellas dactilares cromatográficas. A continuación, se detallan los estudios realizados. 1. Incremento de la capacidad de modelización en cromatografía líquida La fiabilidad de las estrategias interpretativas depende en gran medida de la exactitud de los modelos utilizados en la predicción de los tiempos de retención y perfiles de los picos cromatográficos, que se construyen a partir de la información obtenida de estándares de los analitos. La Memoria de Tesis Doctoral reúne varias contribuciones dedicadas a la optimización de los diseños experimentales empleados en la construcción de modelos. También contiene varias propuestas sobre su aplicación a la obtención de información sobre las interacciones que tienen lugar en el interior de una columna cromatográfica, la estimación de la capacidad de pico tanto en elución isocrática como en gradiente, y la optimización de gradientes que utilizan eluyentes que contienen un tensioactivo en condiciones micelares o submicelares. Los aspectos más relevantes de cada propuesta se describen a continuación. 1.1. Obtención de información sobre las interacciones soluto-fase estacionaria Se prepararon y ensayaron varias columnas monolíticas poliméricas, con un contenido variable de monómeros hidrofóbicos e hidrofílicos, utilizando compuestos apolares (alquilbencenos) y polares (sulfonamidas) como compuestos de prueba. Las columnas incluidas en el estudio fueron las siguientes: una columna formada con lauril-metacrilato (LMA), que le confiere un carácter hidrófobo dominante; una columna de polaridad intermedia con una mezcla de monómeros hidrófobos (LMA) e ionizables (ácido metacrílico, MAA, methacrylic acid); y una columna con un monómero más polar (metacrilato de hexilo, HMA, hexyl methacrylate), combinado con MAA. Se seleccionó como fase estacionaria un monolito compuesto de HMA, MAA y dimetacrilato de etileno (EDMA, ethylene dimethacrylate), en base a la mejor resolución cromatográfica alcanzada y tiempos de análisis razonables, para los dos conjuntos de compuestos de prueba. A pesar de la presencia de grupos de ácido metacrílico de polaridad moderada en la columna monolítica de poli(HMA-co-MAA-co-EDMA), el orden de elución y la distribución regular de los tiempos de retención observados para los alquilbencenos (con carácter apolar) demostró la importancia de las interacciones hidrofóbicas. Por el contrario, el comportamiento de las sulfonamidas (con carácter polar) fue irregular, distribuyéndose los compuestos en tres grupos según su retención, mostrando coelución en la mayoría de las condiciones experimentales ensayadas, con inversiones en los tiempos de retención a elevados contenidos de disolvente orgánico. Sin embargo, la resolución de las sulfonamidas mejoró muy significativamente, respecto a columnas monolíticas previas. Se analizó el comportamiento cromatográfico de los compuestos de prueba, con la columna monolítica seleccionada, modelizando los tiempos de retención y los perfiles de los picos. Se estudió la exactitud de varios modelos de retención, entre los que se incluyó un modelo que describe un mecanismo mixto. Los parámetros ajustados para este modelo sugirieron que el mecanismo de retención se basaba principalmente en la adsorción, para los dos conjuntos de compuestos (alquilbencenos y sulfonamidas). Todos los modelos ensayados proporcionaron predicciones aceptables, con errores relativos a menudo inferiores al 1.0%. El rendimiento de los modelos para la columna monolítica fue similar o superior al encontrado con columnas de RPLC convencionales, cuando se analizan los mismos compuestos. Se obtuvo información sobre el comportamiento de retención de las sulfonamidas con la columna monolítica, a partir de las correlaciones entre los parámetros del modelo logarítmico-cuadrático que incluye la transformación , en lugar del contenido de disolvente orgánico del modelo de retención clásico. La elevada dispersión observada en las correlaciones entre los parámetros del modelo (que cuantifican la fuerza eluyente de la fase móvil y la desviación del modelo de la linealidad), y la ordenada en el origen (que cuantifica el nivel de retención de los solutos), indicó una variabilidad significativa en el comportamiento de retención de las distintas sulfonamidas, respecto al que experimentan los alquilbencenos. Esto se puede explicar por la existencia de diferentes proporciones de interacciones hidrofílicas e hidrofóbicas, en sulfonamidas con diferentes estructuras moleculares, con los monómeros polares y apolares del monolito utilizado como fase estacionaria. Las correlaciones de las semianchuras de los picos con los tiempos de retención, para los cromatogramas obtenidos con las columnas monolíticas y C18 convencionales, revelaron también la diversidad de interacciones para los alquilbencenos y sulfonamidas estudiados. La significativa dispersión observada en la correlación de las semianchuras derechas de los picos, para las sulfonamidas analizadas con la columna monolítica, indicó cinéticas particulares para diversos compuestos, lo que se debe interpretar de nuevo por la diversa participación de monómeros polares y apolares en la columna monolítica, cuando interactúan con las sulfonamidas. 1.2. Búsqueda de diseños experimentales óptimos Los diseños experimentales isocráticos proporcionan la información más rica posible sobre el comportamiento de los solutos, para realizar el ajuste de modelos de retención con parámetros ofreciendo la máxima exactitud, con intervalos de confianza estrechos. Sin embargo, el uso de diseños isocráticos se ve obstaculizado por los largos tiempos de retención de los solutos más apolares, en mezclas con otros analitos, especialmente a bajos contenidos de disolvente orgánico. La solución habitual es utilizar diseños experimentales formados por gradientes de disolvente orgánico, en los que su concentración se incrementa gradualmente para reducir los tiempos de retención. Sin embargo, los diseños que incluyen experiencias de gradiente originan modelos de retención menos exactos y, en consecuencia, su rendimiento en la realización de predicciones es más deficiente. Se exploró, como alternativa, el uso de diseños experimentales isocráticos, en los que se incluyen incrementos bruscos de disolvente orgánico (i.e., pulsos), en las fases móviles de menor fuerza eluyente. Las experiencias con pulsos se pueden considerar como un tipo de gradientes multi-isocráticos, que permiten obtener información cromatográfica para solutos apolares, eluidos con fases móviles que contienen un bajo contenido de disolvente orgánico. El efecto del pulso es trasladar en bloque los tiempos de retención de compuestos con elución tardía en elución isocrática, hacia tiempos más cortos. Los solutos más rápidos eluyen inalterados antes del pulso, y los solutos más retenidos tras el pulso en tiempos de retención aceptables. Este tipo de diseño mixto se puede construir fácilmente, reemplazando las fases móviles isocráticas más lentas por otras que contienen uno o dos pulsos de corta duración, situadas a tiempos intermedios. La ubicación del pulso puede ser arbitraria, pero la mejor opción es situarlo en una región intermedia vacía del cromatograma. Debe tenerse en cuenta que las fases móviles que incorporan un pulso presentan un efecto importante sobre la selectividad y la retención de los solutos que eluyen tras los pulsos. Por ello, la posición, duración e incremento en el contenido de disolvente orgánico del pulso debe adaptarse a cada muestra analizada. La inclusión de pulsos no es práctica con fines de optimización, debido al mayor solapamiento de los picos, especialmente en la región del pulso, y a la fuerte caída en la eficacia de los picos que eluyen tras el pulso. Sin embargo, se obtienen beneficios en la modelización de la retención. Las predicciones de las condiciones de elución, para las fases móviles que contienen pulsos, se realizaron utilizando la ecuación fundamental para la elución en gradiente. Se observó que los tiempos de retención calculados numéricamente mostraban desviaciones notables para los solutos eluidos cerca del pulso, incluso cuando se utilizaba un modelo de retención con bajo error de predicción. Cuando se tuvo en cuenta el retardo intra-columna (i.e., tiempo necesario para que el frente del disolvente alcance al soluto desde la entrada de la columna), las predicciones mejoraron y los cromatogramas predichos coincidieron muy satisfactoriamente con los experimentales. Cuando las predicciones realizadas a partir de diseños que contienen pulsos o gradientes se llevaron a cabo dentro del dominio experimental, la diferencia entre los tiempos predichos y experimentales fue inferior a 0.01 min. Los diseños con pulsos proporcionaron parámetros de los modelos de retención similares a los obtenidos con los diseños isocráticos, que como se ha comentado, son considerados los más exactos para realizar predicciones. Se verificó que los diseños con un solo pulso son los más exactos. Para las predicciones fuera del dominio experimental, la capacidad predictiva de los diseños que contienen pulsos también fue similar a la proporcionada por los diseños con experimentos puramente isocráticos. En general, los diseños que contienen pulsos demostraron ser muy competitivos respecto a los diseños de gradientes, en términos de tiempo de análisis y consumo de disolvente. Aunque los diseños de gradiente con tiempo de gradiente variable ofrecieron tiempos de análisis más cortos y un menor consumo de disolvente orgánico, dieron lugar al mayor error en los parámetros de los modelos de retención y mayores desviaciones en los tiempos de retención extrapolados. Por otro lado, muchos analistas prefieren el uso de gradientes frente a las fases móviles isocráticas, no sólo para la realización de los análisis, sino también para la construcción de diseños experimentales con fines de modelización. Sin embargo, encontrar un diseño con una distribución óptima de gradientes no es sencillo. Con el fin de encontrar los mejores diseños experimentales (formados por experiencias isocráticas o de gradiente), se desarrolló una metodología universal que permite evaluar su calidad. La metodología desarrollada utiliza el principio de optimalidad G, que se basa en la teoría de propagación de errores, y relaciona las propiedades matemáticas de un modelo de retención con una determinada distribución de puntos en un diseño experimental. Se basa en la estimación de la varianza asociada a la predicción de tiempos de retención, utilizando una expresión que considera dos matrices jacobianas asociadas a experimentos de entrenamiento y de muestreo. Las matrices jacobianas implican el cálculo de derivadas parciales de los modelos de retención, para un gran conjunto de condiciones experimentales. Para la elución en gradiente, el tiempo de computación puede ser inasumible, ya que requiere la predicción del tiempo de retención mediante la integración de la ecuación fundamental, lo que puede implicar cálculos masivos. En la Memoria de Tesis Doctoral, se muestra el desarrollo de una metodología práctica, que reduce el tiempo de computación apreciablemente, aprovechando desarrollos recientes realizados en el laboratorio del grupo investigador. Se validó la metodología propuesta verificando la calidad de cinco diseños de entrenamiento, muy utilizados en RPLC para construir modelos para predecir la retención de 14 sulfonamidas de diversa polaridad, considerando diseños de muestreo en elución isocrática y de gradiente. Se comprobó que el modelo de retención propuesto por Neue-Kuss proporciona una mayor exactitud en las predicciones, en comparación al modelo lineal de fuerza eluyente del disolvente (LSS, linear solvent strength), con errores relativos de predicción por debajo del 0.7%. Se encontró que el modelo LSS, que se utiliza ampliamente para elución en gradiente, produce falta de ajuste, por lo que se descartó. Para comparar el rendimiento de los diseños de entrenamiento, se hizo uso de gráficos en los que se representó el valor de las incertidumbres relativas en las predicciones, para las experiencias en los diseños de muestreo para cada compuesto analizado. Las incertidumbres se representaron para los diseños isocráticos frente a la composición de la fase móvil, con incrementos de acetonitrilo del 1%, y para los diseños de gradiente frente a la pendiente de la rampa de un gradiente lineal, con incrementos angulares constantes de 3º. Las incertidumbres relativas proporcionaron resultados más significativos e interpretables que las incertidumbres absolutas, que presentaron fuertes variaciones dependiendo de la retención de los solutos. Un factor crítico para el cálculo de las derivadas de las matrices jacobianas es el nivel de exactitud en el cálculo del tiempo de retención en gradiente. Con un nivel de exactitud insuficiente, se obtienen gráficos de incertidumbre con curvas afectadas de mucho ruido, requiriéndose un nivel de exactitud de aproximadamente 10‒15 para obtener curvas exentas de ruido. En la mayoría de los casos, para la elución en gradiente, se obtuvo un patrón en U característico, con incrementos en ambos extremos y errores más bajos en la zona intermedia. Para todos los diseños de entrenamiento estudiados, las regiones intermedias en los graficos de incertidumbre mostraron un cambio sistemático al disminuir la polaridad de los solutos. La magnitud de la incertidumbre mínima fue similar para las experiencias isocráticas y de gradiente. Sin embargo, los gradientes se predijeron generalmente con incertidumbres más bajas para cualquier diseño experimental, y fueron menos sensibles a la composición de la fase móvil que las predicciones isocráticas. Se confirmó que el mejor diseño de entrenamiento, en la predicción de fases móviles isocráticas y gradientes, es el formado por un conjunto de experiencias isocráticas concentradas gradualmente hacia bajos contenidos de disolvente orgánico (ISO1). Por el contrario, el rendimiento de los diseños de gradiente con tiempo de gradiente fijo y contenido final de disolvente orgánico variable (G1), o contenido final fijo y tiempo de gradiente variable (G2), fue insatisfactorio en la mayoría de situaciones, siendo sólo aceptable para los eluyentes más lentos y los solutos más rápidos. El diseño G3, que combina algunas características de los diseños G1 y G2, proporcionó un rendimiento razonablemente bueno para todos los compuestos de prueba, sólo superado por el diseño ISO1. 1.3. Estimación de la capacidad de pico en base a la simulación de picos cromatográficos La capacidad de pico es un concepto clave en el análisis cromatográfico, que se refiere al número máximo de picos que idealmente se resuelven totalmente en una ventana de tiempo determinada. En RPLC, los cromatogramas tienden a distribuciones de picos desiguales, con solapamientos entre los picos y grandes espacios vacíos. Por ello, la capacidad de pico es un concepto meramente teórico. A pesar de ello, se considera útil para evaluar las posibilidades de una columna cromatográfica para lograr la resolución de los picos, y por ello, ha llamado mucho la atención. Varios autores han propuesto algoritmos para estimar la capacidad de pico en condiciones isocráticas. Neue propuso también un algoritmo para realizar la estimación cuando se utiliza elución en gradiente. Sin embargo, estas estimaciones tienen varias limitaciones, como ser sólo aplicables a picos simétricos, en elución isocrática y utilizando gradientes lineales ignorando el tiempo de retardo (delay time) y la presencia de volúmenes extra-columnares. Además, se asume que el número de platos teóricos es constante. Para superar estas limitaciones, se desarrolló una metodología basada en la simulación de cromatogramas formados por picos de compuestos ficticios, con el mismo tipo de comportamiento que los analitos de interés cuando se analizan con una columna determinada. Los picos de los compuestos ficticios se generan a partir de predicciones de los tiempos de retención y semianchuras de pico, y a continuación, se organizan para cumplir con la definición de capacidad de pico. La predicción de la retención de los picos se realiza utilizando modelos ajustados a partir de la información obtenida de los estándares de un conjunto de compuestos estructuralmente relacionados, de polaridad variable. La propuesta se ilustra utilizando un conjunto de 15 sulfonamidas, analizadas con tres columnas en elución isocrática y aplicando gradientes lineales y multi lineales. El proceso se inicia generando un gran número de picos ficticios con anchuras correspondientes a sus tiempos de retención. El comportamiento de retención se obtiene de la correlación de los parámetros en el modelo logarítmico-cuadrático que incluye la transformación , ajustado con los estándares, mientras que las anchuras de pico se predicen a partir de la correlación de las semianchuras con los tiempos de retención. Una vez generados los picos, se adapta la retención hasta conseguir su conexión a la altura requerida, generalmente asumiendo una anchura de pico de 4σ libre de solapamiento. La metodología propuesta, basada en la simulación de cromatogramas, quedó validada comprobando la buena concordancia al superponer los cromatogramas simulados con los reales, para la mezcla de sulfonamidas en las mismas condiciones de separación. Además, se observó que los valores de capacidad pico con el método propuesto coincidían con los estimados con las ecuaciones clásicas, y posee la ventaja frente a algoritmos anteriores de ser aplicable a una variedad de situaciones en las que éstos no se pueden aplicar, incluida la elución con gradientes multi-lineales complejos y la presencia de picos asimétricos. La posibilidad de simular los cromatogramas permitió la optimización de las condiciones de elución, en multitud de condiciones, de acuerdo a los valores predichos de capacidad de pico. Para ello, se construyeron gráficos de Pareto en los que se representan las predicciones para condiciones isocráticas y utilizando gradientes lineales y multi-lineales (una solución se califica como óptimo de Pareto cuando una respuesta no puede mejorarse sin empeorar otra). Como era de esperar, las separaciones isocráticas presentaron los valores más bajos de capacidad de pico, mientras que los gradientes multi-lineales ofrecieron los valores más elevados, junto a un menor tiempo de análisis. Un sistema cromatográfico no puede proporcionar valores de capacidad de pico fuera de la región limitada por la tendencia isocrática y el límite superior de elución en gradiente. Sin embargo, se encontró para el conjunto de sulfonamidas, que las condiciones de separación que conducían a la mejor resolución estaban lejos de las que proporcionaban la máxima capacidad de pico. Esto significa que una optimización basada en la capacidad de pico sólo puede ser significativa para muestras muy complejas. Para muestras en las que el número de compuestos es relativamente pequeño, se debe atender a los requisitos de resolución específicos para cada soluto. 1.4. Optimización interpretativa en cromatografía líquida micelar con elución isocrática y de gradiente en dominios extendidos de disolvente orgánico Es posible analizar compuestos en un amplio intervalo de estructuras y polaridades, mediante RPLC. Sin embargo, los compuestos orgánicos ionizados y los aniones o metales inorgánicos, que poseen una elevada polaridad, muestran poca o ninguna retención. Otros analitos pueden presentar una retención excesivamente baja o elevada. Una forma de resolver estos problemas ha sido la preparación de nuevas fases estacionarias, pero una solución más sencilla es la adición de reactivos a la fase móvil, que incorporan al sistema cromatográfico una variedad de equilibrios secundarios con las fases estacionaria y móvil. Entre las soluciones más utilizadas en RPLC para modificar la retención utilizando aditivos, se encuentra el uso de tensioactivos en concentraciones a las que forman micelas, lo que ha dado lugar a un modo cromatográfico al que se ha denominado cromatografía líquida micelar (MLC, micellar liquid chromatography). Esta técnica ha mostrado utilidad, especialmente, en el análisis de muestras fisiológicas que no requieren pre tratamiento, ya que las proteínas se solubilizan en presencia del tensioactivo y eluyen cerca del tiempo muerto. La mayoría de los procedimientos descritos en MLC hacen uso del tensioactivo aniónico dodecilsulfato sódico (SDS, sodium dodecyl sulphate). Dado que, para la mayoría de los solutos, la fuerza eluyente de las disoluciones acuosas de SDS es baja, se debe añadir una cantidad relativamente pequeña de disolvente orgánico a la fase móvil para disminuir la retención. En un desarrollo más reciente, la concentración de disolvente orgánico en las disoluciones de tensioactivo se incrementa para obtener tiempos suficientemente cortos, para compuestos altamente retenidos con las columnas alquil-enlazadas. Este modo cromatográfico se ha denominado cromatografía líquida submicelar alta (HSLC, high submicellar liquid chromatography), ya que no se forman micelas a pesar del uso de una concentración relativamente alta del tensioactivo. Los procedimientos descritos en MLC se implementan generalmente en el modo isocrático, ya que el problema general de elución en RPLC (i.e., el aumento exponencial de la retención al disminuir la polaridad de los solutos) es menos problemático. Sin embargo, la elución en gradiente puede también ser útil para analizar, en tiempos más cortos, mezclas de compuestos en un amplio intervalo de polaridades. Los análisis de muestras fisiológicas se pueden realizar utilizando un gradiente que se inicie con una fase móvil que contenga micelas y un bajo contenido de disolvente orgánico, a fin de proporcionar una mejor protección a la columna frente a la precipitación de las proteínas. Una vez que las proteínas se eliminan de la columna, se puede aumentar la fuerza eluyente utilizando un gradiente positivo de disolvente orgánico para reducir los tiempos de retención de compuestos altamente retenidos. Esto da lugar a la transición del modo micelar al submicelar. Para valorar la conveniencia del uso de gradientes frente a la elución isocrática en MLC, considerando un intervalo extendido de disolvente orgánico, se requería aún desarrollar un método de optimización interpretativo para elución en gradiente, basado en la descripción exacta de la retención. Para ello, se abordó el cribado de un conjunto de ocho compuestos básicos (antagonistas de los receptores β-adrenérgicos), en muestras de orina, realizando los análisis mediante inyección directa con columnas C8 o C18 y utilizando disoluciones acuosas de SDS con disolvente orgánico añadido. Se estudió el rendimiento de tres disolventes orgánicos (acetonitrilo, etanol y 1-propanol), a concentraciones variables de SDS. Con acetonitrilo, se consiguió resolución completa, pero el tiempo de análisis fue excesivo. El etanol y el 1-propanol ofrecieron un tiempo de análisis aceptable, pero la resolución máxima alcanzada con el etanol fue demasiado baja. Por lo tanto, se seleccionó el 1 propanol para realizar los análisis. Por otro lado, se comparó la exactitud que ofrecían nueve modelos (algunos de ellos propuestos previamente para MLC y HSLC), para predecir la retención utilizando las concentraciones de SDS y 1 propanol como variables. La ecuación que mostró la mejor capacidad predictiva, en dominios extendidos de disolvente orgánico, ofreció errores relativos entre el 0.3 y 1.7%. Cuando se analizan muestras fisiológicas mediante inyección directa, además de los fármacos administrados, los cromatogramas contienen un pico prominente correspondiente a un compuesto endógeno que eluye a tiempos de retención relativamente cortos. Este compuesto (cuya identidad desconocíamos) debía modelizarse para ser considerado en la optimización de la resolución. La información sobre su comportamiento de retención se consiguió a partir de los picos obtenidos al inyectar orina, manteniendo la concentración de 1-propanol suficientemente baja para evitar la precipitación de las proteínas. Se realizó un estudio detallado para conocer la idoneidad de las columnas C8 y C18 en el análisis de los compuestos básicos, con inyección directa de la muestra de orina utilizando fases móviles isocráticas, y gradientes lineales o multi-lineales. La optimización de las condiciones de elución en modo isocrático proporcionó una buena resolución y un tiempo de análisis razonable (alrededor de 25 min), para ambas columnas, utilizando una concentración alta de SDS y un contenido de disolvente orgánico por debajo del 15%, lo que evitó la precipitación de las proteínas de la muestra. Se observó una buena concordancia entre los cromatogramas predichos y experimentales, para ambas columnas. Los gradientes lineales simples dieron lugar a una reducción significativa del tiempo de análisis, respecto a la elución isocrática. Se encontró que la inclusión de una etapa isocrática inicial con una baja concentración de disolvente orgánico era perjudicial para lograr una buena resolución. Se observaron problemas de línea de base con la columna C18, lo que producía desviaciones en la predicción de las señales. Por el contrario, la concordancia entre los cromatogramas predichos y experimentales fue excelente para la columna C8. Estos comportamientos pueden explicarse por la mayor capacidad de adsorción del tensioactivo sobre la columna C18, respecto a la columna C8, que es desorbido gradualmente por el disolvente orgánico a lo largo del gradiente. En general, la implementación de gradientes multi-lineales con eluyentes que contienen tensioactivo, y cambios repentinos en las pendientes, origina una perturbación importante de la línea base, particularmente con la columna C18. Para la columna C8, los gradientes multi-lineales redujeron significativamente el tiempo de análisis manteniendo una buena resolución, y una buena concordancia entre los cromatogramas predichos y experimentales. Por lo tanto, es preferible el uso de gradientes lineales con la columna C8 para realizar estos análisis. 2. Optimización de la separación en huellas dactilares cromatográficas Como se ha comentado, la búsqueda de las mejores condiciones de separación en cromatografía líquida se puede realizar utilizando la información obtenida con estándares de los analitos. Sin embargo, sigue siendo un desafío la obtención de información útil para muestras que contienen una gran cantidad de compuestos. La mayor dificultad corresponde a muestras para las que no se dispone de información previa sobre su composición química, al menos para algunos compuestos. También existe la posibilidad de que no se hallen disponibles los estándares de los compuestos analizados, necesarios para predecir las condiciones óptimas de separación con las estrategias interpretativas convencionales. Independientemente de que se conozca o no la identidad de los compuestos que originan picos en un cromatograma, su separación mutua debe ser lo mayor posible, tanto para fines cualitativos como cuantitativos. Un caso extremo es la obtención de las denominadas huellas dactilares cromatográficas, donde la distribución y magnitud relativas de los picos son las características relevantes. En estas muestras, una mejor resolución puede ofrecer cromatogramas más informativos. La Memoria de Tesis Doctoral incluye propuestas para mejorar el procesamiento de las señales en cromatogramas complejos, la estimación de la resolución en huellas dactilares de hierbas medicinales mediante cromatografía líquida mono dimensional, y la optimización de la separación de compuestos polifenólicos en huellas dactilares de extractos de hoja y pulpa de olivo, mediante cromatografía líquida bidimensional.   2.1. Sustracción de la línea base en cromatogramas complejos mediante un algoritmo basado en la discriminación de frecuencias El procesamiento de las señales en cromatogramas de muestras complejas puede constituir un cuello de botella en la obtención de información significativa. Un problema importante que debe abordarse antes de tratar las señales es la sustracción de la línea base, que puede ser notablemente irregular, e idealmente debería realizarse sin supervisión. Una herramienta interesante, desarrollada recientemente para la sustracción de la línea base, es el algoritmo BEADS, que realiza una descomposición completa de los cromatogramas mediante el uso de filtros de frecuencia altamente eficientes, que separan las señales puras de los compuestos (descritas como señales dispersas), de la línea base (con una frecuencia baja) y el ruido (contribuciones de elevada frecuencia). Sin embargo, el algoritmo inicialmente propuesto requiere, para procesar correctamente las señales, una selección cuidadosa de los parámetros de trabajo, especialmente la frecuencia de corte que es el parámetro más crítico. Dicha selección debe realizarse mediante prueba y error, dando lugar a un proceso demasiado lento e inestable. Por otro lado, la aplicación del BEADS original a cromatogramas que contienen picos de magnitud extremadamente distinta origina deformaciones en la línea base, que aparecen como pequeñas ondulaciones debajo de los picos principales, asociadas a las grandes diferencias de escala entre los componentes mayoritarios y las trazas. Además, la presencia de señales negativas en los cromatogramas afecta gravemente a la sustracción de la línea base. Para mejorar el rendimiento y fiabilidad del algoritmo BEADS, la Memoria de Tesis Doctoral incluye la propuesta de modificaciones de diverso tipo, a lo que se ha denominado BEADS asistido, ya que la selección de los parámetros de trabajo óptimos se simplifica en base al empleo de gráficos de autocorrelación auxiliares. Una característica importante del algoritmo BEADS modificado es la transformación logarítmica de las señales originales, que elimina las irregularidades observadas en la línea base debajo de los picos de mayor tamaño. La transformación logarítmica reduce el peso de estos picos, lo que conduce a líneas base suavizadas. Al realizar la transformación logarítmica de la señal, se obtuvieron gráficas escalonadas para cada parámetro de trabajo, cuyo valor óptimo se ubicó cerca del punto de inflexión. El BEADS asistido puede adaptarse fácilmente a cualquier tipo de muestra, proporcionando una sustracción de la línea base satisfactoria para todas las muestras analizadas, independientemente de su complejidad. El algoritmo propuesto reduce la subjetividad en la selección de los parámetros de trabajo y proporciona resultados siempre fiables. La selección de la frecuencia de corte óptima, que constituye el límite entre la línea base y el resto de contribuciones (señales dispersas y ruido), es menos crítica en comparación con el algoritmo original. Los efectos de las señales negativas esporádicas, tras la substracción de la línea base, se corrigieron mediante la implementación de un proceso iterativo. Cabe señalar que BEADS realiza un ajuste global de la línea base. Ello implica la pérdida de detalle en regiones particulares del cromatograma, respecto al ajuste local de la línea base (que sólo considera el entorno de un pico). Sin embargo, la magnitud de los errores obtenidos con el BEADS asistido fue muy aceptable. Debe, por último destacarse, que la aplicación de BEADS asistido no se limita únicamente a las señales cromatográficas. 2.2. Desarrollo de un criterio de resolución para caracterizar cromatogramas complejos cuando no se dispone de estándares El objetivo de las estrategias de optimización interpretativa es la búsqueda de condiciones experimentales que originen la mejor resolución, en base a la predicción de tiempos de retención y perfiles de los picos de los analitos de interés, con los que se construyen cromatogramas simulados. La mayoría de los criterios de resolución utilizados para medir la calidad de una separación requieren de estándares de los analitos, para ajustar los modelos con los que se realizan las predicciones. Sin embargo, para algunas muestras, no hay estándares disponibles. Por lo tanto, se pensó en desarrollar una función de resolución global, válida para todas las situaciones (con o sin estándares). La función propuesta se basa en la medida de la prominencia de pico, que es la fracción de área que excede la línea que une los valles que delimitan cada pico. El criterio de prominencia de pico se validó mediante la comparación de los resultados con los obtenidos con el criterio de pureza de pico, que mide el área de pico libre de solapamiento y proporciona estimaciones fiables de la resolución cromatográfica. El criterio de pureza de pico requiere un conocimiento exhaustivo de las señales individuales de cada analito, en cada condición del diseño experimental, a lo que sólo se puede acceder mediante simulación basada en la información proporcionada por estándares. Por el contrario, la prominencia de pico se puede medir directamente a partir de las señales en un cromatograma real, sin ningún conocimiento previo de los compuestos que contiene la muestra. Para comparar los criterios de prominencia y pureza de pico, se obtuvieron los cromatogramas para un conjunto de aminoácidos derivatizados con o ftalaldehído y N acetilcisteína, en condiciones isocráticas y de gradiente. Con los datos obtenidos de los estándares para 10 condiciones de elución isocráticas, se construyeron modelos de retención y semianchura de pico. Con estos modelos, se predijo la separación en alrededor de 1100 gradientes lineales y multi-lineales. Los aminoácidos derivatizados sólo se pudieron resolver a tiempos de análisis elevados, incluso utilizando gradientes multi-isocráticos y multi-lineales. Cuando se intentó reducir el tiempo de análisis, se produjo un solapamiento significativo para varios compuestos. Este comportamiento dio lugar a casos de estudio de interés para la evaluación de las funciones de resolución. El estudio comparativo se llevó a cabo con la ayuda de gráficos de optimalidad de Pareto. Los gráficos se trazaron para ambos criterios de prominencia y pureza de pico, considerando las dos medidas de calidad opuestas a mejorar: la resolución cromatográfica y el tiempo de análisis. Se obtuvieron gráficos para varias situaciones simuladas: señales de diferente magnitud, inclusión de ruido instrumental, líneas base reales y presencia de compuestos desconocidos. Se estudiaron tres funciones como candidatas para medir la prominencia de pico global, que se compararon con la pureza de pico global expresada como la suma de los valores individuales. La suma de las resoluciones individuales normalizadas resultó la mejor función, ya que la proyección de los gradientes óptimos para el frente de Pareto, para esa función, coincidieron con los obtenidos para el frente de Pareto obtenido para la suma de las purezas de pico. La mejor función de prominencia global se aplicó con éxito a la evaluación de la resolución de huellas dactilares cromatográficas de extractos de hierbas medicinales, que contenían un gran número de componentes cuya identidad se desconocía. El criterio de resolución propuesto posee la ventaja de poderse evaluar directamente a partir de los cromatogramas experimentales, sin requerir etapas de modelización, predicción y simulación, utilizando información obtenida de estándares, como es el caso de la pureza pico. 2.3. Clasificación de extractos de hojas y pulpa de olivo mediante cromatografía líquida bidimensional Los extractos de hojas y pulpa de olivo son mezclas complejas de cientos de compuestos diferentes. Entre ellos, los polifenoles han atraído mucha atención debido a sus efectos beneficios para la salud. Los análisis de polifenoles se suelen realizar mediante cromatografía líquida mono-dimensional. Sin embargo, la complejidad de las muestras no permite que la resolución completa sea posible. Por ello, se investigó la posibilidad de utilizar cromatografía líquida bidimensional en el modo LC×LC (comprehensive two-dimensional liquid chromatography), para realizar los análisis. Este modo cromatográfico combina dos columnas con diferentes mecanismos de separación, para obtener una máxima resolución en el análisis de muestras complejas dando lugar a cromatogramas en dos dimensiones. Se evaluó la capacidad separadora de varias columnas (con diferente fase estacionaria, longitud, diámetro interno, así como distintos tamaños de poro y partícula), a fin de obtener el número máximo de picos visibles (i.e., capacidad de pico), en el análisis de huellas dactilares polifenólicas, haciendo uso de distintas condiciones de elución. A lo largo del estudio, se consideraron tres fases estacionarias en la primera dimensión (C18 convencional y C18 con grupos fenilo o pentafluorofenilo), y cinco en la segunda dimensión (C18, amido, ciano, fenilo y pentafluorofenilo). La separación en la primera dimensión se realizó con gradientes de metanol-agua, mientras que en la segunda dimensión, se hizo uso de gradientes de acetonitrilo-agua. La optimización de la mejor combinación de columnas se inició utilizando columnas convencionales C18 y ciano en la primera y segunda dimensión, respectivamente, y un gradiente convencional, lo que dio lugar a un número demasiado reducido de picos visibles (29 para los extractos de hojas de olivo). La sustitución de la columna ciano por una columna de pentafluorofenilo convencional, junto con la reducción del tiempo de modulación (tiempo de recogida del efluente de la primera dimensión antes de ser inyectado en la segunda dimensión) incrementaron el número de picos a 73. Finalmente, utilizando columnas submicro (C18 de 1.8 µm de diámetro interno en la primera dimensión, y pentafluorofenilo de 2.6 µm en la segunda), cambiando el orden de las columnas (pentafluorofenilo en la primera dimensión), y aplicando en la segunda dimensión un gradiente que desplazaba gradualmente los extremos del gradiente a valores más altos, se lograron huellas dactilares más informativas con 112 y 109 picos visibles para los extractos de hojas de olivo y pulpa, respectivamente. El método LC×LC optimizado se aplicó con éxito a la confirmación de la presencia de 26 picos comunes en los extractos de hojas de olivo y 29 en los de pulpa. Para estos compuestos, se seleccionó el volumen relativo de los picos (menos sensible al proceso de extracción que el volumen absoluto), con el fin de desarrollar un modelo de análisis discriminante lineal (LDA, linear discriminant analysis), capaz de distinguir la procedencia de los extractos. Se trazaron gráficos tridimensionales con las puntuaciones obtenidas a partir de la información proporcionada por los cromatogramas LC×LC de los extractos de hoja y pulpa de olivo, de acuerdo a las tres primeras funciones discriminantes. Los gráficos mostraron que todas las muestras pertenecientes a una clase determinada aparecían en grupos compactos. Los modelos LDA resultantes permitieron la correcta clasificación de siete cultivos de distinto origen genético, para las hojas y pulpa de olivo de varias regiones españolas, obteniéndose una excelente separación entre categorías, con un alto nivel de confianza. Esto demuestra que los perfiles polifenólicos son característicos de cada cultivo.