Devlopment of mathods in microemulsion liquid chromatography

Resumen

La Cromatografía Líquida de Microemulsiones (MELC, Microemulsion Liquid Chromatography) es un modo de la Cromatografía Líquida de Fase Inversa (RPLC, Reversed-Phase Liquid Chromatography), en el que las fases móviles contienen microemulsiones (MEs) de aceite en agua, lo que da lugar a nuevas interacciones de los solutos con el sistema cromatográfico. Las MEs se obtienen de forma espontánea mezclando dos líquidos inmiscibles (agua y aceite), en presencia de un surfactante. A menudo también se requiere un co-surfactante para estabilizarlas. Una mezcla agua / aceite origina dos fases inmiscibles, debido a la gran tensión superficial que existe entre los dos líquidos. Sin embargo, en presencia de un surfactante, se obtiene un sistema líquido organizado, macroscópicamente homogéneo y termodinámicamente estable. Las moléculas del surfactante están formadas por una larga cola apolar y una cabeza polar. Al incorporar el surfactante en la mezcla agua / aceite, se forma una microestructura que proporciona un límite definido entre las fases oleosa y acuosa: el aceite penetra en la micela que forma el surfactante y se estabiliza en su interior en forma de gotas diminutas. La naturaleza compleja de las fases móviles en MELC da lugar a numerosas opciones de composición, en cuanto al tipo y concentración del surfactante, aceite y co-surfactante, que pueden dar lugar a separaciones muy satisfactorias, en comparación con otros modos cromatográficos. Uno de los principales atractivos de las MEs de aceite en agua es su capacidad para solubilizar compuestos en una amplia gama de polaridades, desde compuestos polares a altamente hidrofóbicos, lo que es de gran interés en muchos campos. El efecto solubilizante sobre las matrices apolares de algunas muestras también es importante, Todo ello permite analizar mezclas de compuestos de diferentes polaridades y realizar la inyección directa de las muestras, lo que en RPLC convencional requiere largos tratamientos previos. La mayoría de las aplicaciones en MELC corresponden al análisis de muestras que contienen compuestos hidrofóbicos en productos farmacéuticos apolares (cremas, ungüentos y supositorios), además de fluidos fisiológicos y otras matrices biológicas. Sin embargo, la técnica presenta algunos inconvenientes que deben tenerse en cuenta: la adsorción del surfactante sobre las fases estacionarias de base sílice, la mayor viscosidad de la fase móvil que puede originar elevadas presiones, la necesidad de incrementar los cuidados de la columna y la correcta selección del tipo y concentración del disolvente orgánico apolar utilizado para formar las micro-gotas en la ME. La Memoria de Tesis Doctoral presentada incluye estudios fundamentales que incrementan el conocimiento sobre la MELC. También muestra la aplicación de la técnica al análisis de preparados farmacéuticos. Con este propósito, se utilizan fases móviles que contienen el surfactante aniónico dodecilsulfato sódico (SDS, sodium dodecyl sulphate), octano como disolvente apolar (aceite) y 1-butanol como co-surfactante. También se explora el uso de líquidos iónicos en las MEs, en lugar de octano. Los estudios se han realizado con varios compuestos: los parabenos butilparabeno, etilparabeno, metilparabeno y propilparabeno, y dos grupos de compuestos básicos, los antagonistas de los receptores β-adrenérgicos acebutolol, atenolol, celiprolol, carteolol, esmolol, labetalol, metoprolol, oxprenolol, pindolol, propranolol y timolol, y los antidepresivos tricíclicos (TCAs, tricyclic antidepressants) amitriptilina, clomipramina, imipramina, maprotilina y nortriptilina. Los estudios realizados sobre el comportamiento cromatográfico de estos analitos consideraron tanto el comportamiento de retención, como el perfil de los picos. Las investigaciones incluidas en la Memoria de Tesis Doctoral suponen una nueva línea de trabajo para el grupo investigador al que pertenecen las supervisoras del trabajo realizado. El grupo se interesó, a partir de 1988, en el uso de medios organizados realizando una serie de estudios donde se utilizaban micelas de surfactante para aumentar la absortividad y fluorescencia en diversos métodos analíticos espectroscópicos. Tras los contactos mantenidos con el Profesor Alain Berthod de la Universidad Claude Bernard de Lyon (Francia), que había realizado investigaciones pioneras en el campo de la Cromatografía Líquida Micelar (MLC, Micellar Liquid Chromatography), el grupo inició en 1991 investigaciones en este modo cromatográfico. Posteriormente, a partir de 2008, las supervisoras del trabajo de Tesis Doctoral se interesaron en el uso de fases móviles en las que se añade una cantidad relativamente elevada de disolvente orgánico a una disolución de surfactante, para evitar la formación de micelas (HSLC, High Submicellar Liquid Chromatography). En esta Tesis Doctoral, el grupo inicia estudios sobre el uso de MEs como fases móviles en cromatografía líquida. Ambos medios submicelares y MEs poseen el interés de permitir la elución de compuestos fuertemente retenidos en MLC. El número de artículos publicados en MELC es aún limitado, pero varios investigadores han ofrecido información muy valiosa. En cualquier caso, es evidente que este modo cromatográfico está recibiendo una atención creciente. Sin embargo, a pesar de la publicación de algunos artículos de revisión sobre MELC previos al inicio de esta Tesis Doctoral, la información proporcionada era contradictoria y confusa. Se debe considerar que las fases móviles preparadas con MEs son complejas, ya que requieren la mezcla de al menos tres reactivos en medio acuoso, de los que se han propuesto una amplia variedad, especialmente para el disolvente apolar y el co-surfactante. Por lo tanto, antes de iniciar las investigaciones en MELC, se consideró necesario conocer en profundidad la información conocida hasta la fecha. Así, el trabajo de Tesis Doctoral se inició con la realización de un estudio detallado de la bibliografía existente, lo que dio lugar a la preparación de dos artículos de revisión que expusieron críticamente los aspectos fundamentales de la técnica y la selección de condiciones experimentales. Los artículos de revisión realizados al inicio de la Tesis Doctoral constituyen una amplia recopilación de la información existente sobre los diferentes factores involucrados en la MELC, y actualiza los conocimientos sobre la técnica. Además, analiza los factores que conducen a una separación satisfactoria. Todo ello ha dado lugar a una guía introductoria, que puede ser útil para los investigadores interesados en esta modalidad cromatográfica e incentivar el desarrollo de procedimientos analíticos en MELC, que se muestra como una técnica competitiva frente al uso de otras modalidades de RPLC para el análisis de compuestos apolares. Finalmente, se ofrecen consejos prácticos para preparar fases móviles preparadas con MEs estables, que conduzcan a resultados reproducibles. Los aspectos más interesantes encontrados en la bibliografía, en relación al trabajo experimental en MELC, se refieren a la naturaleza y concentración de los reactivos para preparar las MEs utilizadas como fases móviles. Otros aspectos relevantes son el estudio de los mecanismos de retención, la selectividad y la práctica experimental para la determinación de fármacos en muestras clínicas y farmacéuticas. Las MEs ofrecen una selectividad única y tiempos de retención más bajos, con una eficacia equivalente o superior a la obtenida en la RPLC convencional, lo que conduce a separaciones isocráticas satisfactorias. Se reduce así el problema existente en RPLC convencional relativo al incremento exponencial en la retención de compuestos de polaridad decreciente (el denominado problema general de elución cromatográfica), haciendo menos necesaria la elución con gradientes de disolvente orgánico. Los investigadores que trabajan en MELC indican que el uso de MEs es competitivo para algunos analitos, frente a otras fases móviles preparadas en presencia o ausencia de surfactante. Además, las MEs son amigables con el medio ambiente, ya que se reducen la contaminación y los residuos en los laboratorios. La complejidad de la composición de una ME adecuada para cromatografía líquida, y el hecho de que los diferentes factores que inciden en el comportamiento cromatográfico interactúan entre sí, pueden requerir muchas manipulaciones durante el desarrollo de un método hasta lograr una separación aceptable para mezclas complejas multi-analito. Éste es el motivo de la propuesta de varios autores de utilizar una ME que ha sido seleccionada como punto de partida, a la hora de desarrollar un método para una nueva separación de la que no se posee información previa. En base a estas condiciones iniciales, varios investigadores han propuesto el uso de metodologías asistidas por ordenador para optimizar la composición de la fase móvil en MELC, lo que reduce significativamente el tiempo y el consumo de reactivos para el desarrollo de los métodos. A lo largo del trabajo desarrollado, recogido en la Memoria de Tesis Doctoral, se logró un alto dominio de la técnica, lo que condujo a nuevas recomendaciones para implementar procedimientos analíticos. Se resumen a continuación, los aspectos más relevantes del trabajo experimental realizado: A) Comparación de modos cromatográficos que utilizan el surfactante dodecilsulfato sódico para el análisis de fármacos básicos El grupo investigador en el que se integran las investigaciones recogidas en la Memoria de Tesis Doctoral posee una larga experiencia en el desarrollo de métodos para el análisis de compuestos básicos, que se iniciaron en 1996. Los compuestos básicos son de gran interés en farmacología, puesto que muchos principios activos poseen este carácter. Por otro lado, su control se realiza principalmente mediante cromatografía líquida. Sin embargo, el análisis de compuestos básicos mediante RPLC convencional ha sido un desafío desde sus inicios, ya que en el intervalo de pH habitual de la fase móvil (por debajo de 7), estos compuestos dan lugar a especies protonadas catiónicas, que interactúan con los silanoles aniónicos libres existentes en las fases estacionarias de base sílice (las más usuales en la práctica experimental). Ello produce un rendimiento deficiente (mayor retención y formación de picos anchos que muestran colas). El perfil de los picos puede mejorarse significativamente añadiendo diversos reactivos (aditivos), que se adsorben sobre la fase estacionaria, como algunos surfactantes o líquidos iónicos, que recubren la columna, impidiendo el acceso de los solutos a los silanoles libres con carácter aniónico. El grupo investigador ha demostrado que, además de las aminas convencionalmente utilizadas como aditivos en RPLC, la adición de SDS a las fases móviles en MLC es capaz de suprimir el efecto adverso de los silanoles. Las largas cadenas hidrofóbicas de los monómeros de SDS se asocian a las cadenas alquílicas de las fases estacionarias (generalmente C18), con el grupo sulfato orientado hacia el exterior de la superficie. Ello crea una fase estacionaria con carga negativa que enmascara los silanoles, pero que también atrae a los solutos catiónicos. Esto es un inconveniente, ya que da lugar a tiempos de retención prolongados, lo que obliga a añadir una gran cantidad de disolvente orgánico a la fase móvil para aumentar la fuerza eluyente. En estudios realizados por el grupo, a partir de 2008, se encontró que cuando se utiliza SDS en concentración moderada en presencia de un alto contenido de disolvente orgánico, como 1-propanol, se obtienen procedimientos ventajosos de HSLC, a pesar de no formarse micelas. Al comienzo del trabajo de Tesis Doctoral, se pensó que la MELC podría ser aún más ventajosa, ya que puede permitir reducir aún más la cantidad de disolvente orgánico, dando lugar a un método más ecológico. No existía ninguna referencia previa que describiera la aplicación de la MELC a compuestos básicos. Por lo tanto, se consideró que podría tener interés realizar un estudio detallado a fin de examinar esta posibilidad, comparando exhaustivamente la MELC con los resultados obtenidos utilizando RPLC convencional, MLC y HSLC, las dos últimas técnicas haciendo uso también del surfactante aniónico SDS. Se realizó así un estudio exhaustivo del cambio del comportamiento en la retención y la forma de los picos cromatográficos, a medida que se modificaba el ambiente dentro de la columna (presencia de micelas o monómeros de surfactante y naturaleza de la fase estacionaria), al utilizar los distintos modos cromatográficos. La Memoria incluye una extensa discusión sobre el comportamiento observado cuando se modifica la concentración de SDS (en los modos de cromatografía líquida que utilizan surfactante), octano (en MELC), y los disolventes orgánicos acetonitrilo, 1 propanol y 1-butanol (en todas las técnicas estudiadas). En las investigaciones realizadas, se utilizó un grupo de once antagonistas de los receptores β adrenérgicos (acebutolol, atenolol, carteolol, celiprolol, esmolol, labetalol, metoprolol, oxprenolol, pindolol, propranolol, y timolol), como compuestos de prueba. Este grupo de compuestos es ideal para estudiar el comportamiento de los compuestos básicos, ya que existe una gran cantidad de ellos comercializados con diversas polaridades, y la cinética de interacción con la fase estacionaria para diferentes compuestos es similar. Se examinó el efecto producido al variar diferentes factores experimentales, observándose los cambios en la retención y el perfil de los picos de los solutos, que afectan a la resolución. Otro factor examinado fue el consumo de disolvente orgánico. El estudio mostró las posibilidades de la MLC, HSLC y MELC. Los tiempos de retención de los compuestos básicos, demasiado elevados cuando se utilizan fases móviles que contienen únicamente surfactante, pueden modularse a valores prácticos mediante la adición de diferentes cantidades de uno o dos disolventes orgánicos, dando lugar a procedimientos competitivos. Los medios submicelares (HSLC) reducen la retención y mejoran la eficacia cromatográfica, en la separación de los antagonistas de los receptores β-adrenérgicos, en comparación con la RPLC convencional y la MLC. Además, la MELC da lugar a tiempos de análisis muy cortos, y requiere una menor cantidad de disolvente orgánico para eluir los solutos más retenidos, en comparación con el modo submicelar. La obtención de picos más estrechos y simétricos en MLC, HSLC y MELC, respecto a la RPLC convencional, indica un enmascaramiento eficaz de los silanoles. En MELC, los intervalos de concentración explorados fueron 0.104-0.173 M para SDS (lo que garantizaba la formación de micelas), 8.2-17.3 % para 1-butanol y 0.28-1.28 % para octano. Fuera de estos intervalos, las MEs no son estables o no pueden formarse. La concentración de 1-butanol no se pudo incrementar por encima del 17.3 %, debido a la presión excesiva en la columna, que podría resultar dañada. La modalidad de HSLC utilizando acetonitrilo ofrece los perfiles de pico más satisfactorios. Sin embargo, el elevado volumen de disolvente orgánico que requiere la HSLC para lograr tiempos de retención suficientemente cortos, para la mayoría de solutos hidrofóbicos, hace que este modo cromatográfico sea menos atractivo. Por el contrario, la MELC reduce significativamente los tiempos de retención utilizando cantidades muy pequeñas de los disolventes orgánicos (1-butanol y octano). Mediante una optimización adecuada, es posible conseguir resolución satisfactoria en la separación de mezclas de los antagonistas de los receptores β adrenérgicos en tan sólo unos minutos. En general, los picos cromatográficos se caracterizan por su altura, posición, anchura y asimetría, dependiendo las dos últimas de los valores de las semi-anchuras de pico izquierda y derecha. Hace una década, el grupo investigador confirmó que se obtienen correlaciones simples entre los valores de las semi-anchuras de pico y sus tiempos de retención, a las que denominó gráficos de semi-anchura. Para la elución isocrática, las representaciones son en realidad parabólicas, aunque a menudo las parábolas se pueden aproximar a líneas recta. Los gráficos se obtienen con los datos de las semi-anchuras y tiempos de retención, para un conjunto de solutos que experimentan la misma cinética de interacción, cuando son eluidos con una misma fase móvil o fases móviles de composición variable. Cuando la resistencia a la transferencia de masa depende de la naturaleza de los solutos, los gráficos muestran una cierta dispersión. En la Memoria de Tesis, se muestra que los gráficos de semi-anchura constituyen una herramienta muy útil para la predicción de los perfiles de los picos en los cromatogramas. Además, revelan el grado de similitud de la cinética de interacción de los solutos, cuando se analizan en diferentes condiciones. Los datos experimentales recogidos en el trabajo de Tesis Doctoral permitieron una comparación global del rendimiento de cuatro modos cromatográficos (RPLC convencional, MLC, HSLC y MELC). La reducción significativa en el efecto silanol en los modos en los que se utiliza surfactante fue significativa. La característica más destacable es que las pendientes de los gráficos para las semi-anchuras derecha e izquierda son similares, debido a la formación de picos casi simétricos a diversos tiempos de retención. En RPLC convencional, los picos muestran una cola significativa mientras que en HSLC con 1-propanol, los picos pasan de tener cola a presentar deformación frontal a bajas concentraciones de SDS (0.02-0.04 M) y una concentración elevada de 1 propanol (25 %). Las altas eficacias obtenidas en HSLC y MELC garantizan una alta resolución. El orden de elución de los antagonistas de los receptores β adrenérgicos en MLC y HSLC se modificó respecto al encontrado en RPLC convencional, y también fue distinto entre HSLC y MELC. La resolución de los picos fue máxima con la fase móvil que contenía SDS y acetonitrilo al 35% (HSLC), debido a la mayor anchura de los picos en MELC, aunque a costa de un mayor consumo de disolvente orgánico.   B) Modelización de la retención en Cromatografía Líquida de Microemulsiones La modelización de la retención, en función de la composición de la fase móvil, es una tarea frecuente en la práctica cromatográfica, de gran importancia en cromatografía líquida para encontrar las condiciones óptimas de separación y comprender el mecanismo de retención de los compuestos eluidos. El grupo investigador poseía experiencia previa en la modelización de la retención en RPLC convencional con fases móviles hidro orgánicas, así como con fases móviles en presencia de aditivos, con excelentes resultados. Aunque existían algunos antecedentes en el campo de la optimización en MELC, los métodos no eran de tipo interpretativo (i.e., basados en modelos). Por lo tanto, se consideró interesante desarrollar una ecuación matemática que permitiera la descripción del efecto, sobre la retención de compuestos de diversa naturaleza, de cada uno de los tres factores con los que se trabaja en MELC (concentraciones de SDS, octano y 1-butanol), considerando su interacción mutua. El estudio se realizó utilizando dos grupos de compuestos de distinta naturaleza: parabenos y antagonistas de los receptores β-adrenérgicos. El uso de fases móviles micelares puras (i.e., sin disolvente orgánico) dio lugar a tiempos de retención extremadamente elevados para ambas familias de compuestos, por lo que no resultaron prácticas para su análisis. Para obtener tiempos de retención suficientemente cortos para estos compuestos, fue necesario añadir un disolvente orgánico que ofreciera una elevada fuerza eluyente, tal como 1-butanol. En MELC, los tiempos de análisis de mezclas de parabenos y antagonistas de los receptores β adrenérgicos se redujeron aún más mediante la adición de octano. Así, por ejemplo, el tiempo de análisis para parabenos y los compuestos básicos fue 5 y 6.5 min, respectivamente, utilizando una fase móvil que contenía SDS 0.10 M / 1 % de octano y 7 % de 1-butanol (MELC), y 4.4 y 5.7 min con SDS 0.18 M / 12 % de 1-butanol (MLC en presencia de una elevada cantidad de surfactante). En la bibliografía sobre MELC, no se encontró ningún estudio riguroso sobre los intervalos de concentración de los reactivos que deben mezclarse para formar MEs estables. Para garantizar el éxito en la formación de MEs, no sólo es importante la elección de los reactivos, sino también su concentración en la fase móvil. Así, puesto que interesaba investigar la calidad de la modelización de la retención en amplios intervalos de concentración, era necesario asegurar previamente los intervalos que originaban una ME, en lugar de una emulsión. Por lo tanto, con el objetivo de verificar la formación de un medio transparente, apto para ser utilizado en cromatografía líquida, se realizó previamente un estudio basado en la observación visual de las mezclas, en el que se establecieron los intervalos de concentraciones de SDS, octano y 1-butanol que es posible mezclar para formar una ME estable, evitando la formación de una emulsión que pudiera dañar al equipo o a la columna. El estudio mostró también el periodo de tiempo en el que las MEs permanecen estables. Tras mezclar los reactivos, se dejaron reposar las mezclas durante al menos 12 horas. Posteriormente se centrifugaron, y cuando inicialmente no dieron lugar a dos fases bien diferenciadas (i.e., una emulsión), se dejaron varias semanas en reposo para comprobar su estabilidad. Se obtuvo un gráfico que representaba los límites de octano y 1-butanol en los que las MEs son estables, a dos concentraciones de SDS (0.10 M y 0.18 M). El gráfico de concentraciones indicó que con una cantidad relativamente baja de 1-butanol y SDS 0.10 M, y una concentración creciente de octano, las MEs son inestables, después de algunas semanas, pero al incrementar la cantidad de SDS a 0.18 M no se observó la separación de las fases agua y octano. A pesar del beneficio que el uso de una mayor concentración de 1-butanol podría suponer para solubilizar una mayor cantidad de octano, el límite superior de concentración de co-surfactante se limitó para evitar altas presiones, lo que podría producir daños a la columna e instrumento. Por otro lado, al añadir una cantidad baja de octano (0.2%), la separación de fases no fue visible para ninguna concentración de SDS ensayada, incluso a concentraciones muy bajas de 1-butanol. Esto indicó que el surfactante es capaz de solubilizar pequeñas cantidades de octano, sin la necesidad de co surfactante. Finalmente, con el objetivo de preservar el rendimiento de la columna, evitar daños al instrumento y reducir el impacto ambiental, se fijó el límite superior de 1 butanol a un 12 %, tanto en ausencia como en presencia de octano (MLC y MELC, respectivamente). Se demostró la viabilidad de modelizar la retención en MELC, con una exactitud satisfactoria, considerando simultáneamente los tres componentes de la fase móvil (surfactante, alcohol y aceite), con errores en el intervalo entre el 1.1 y el 2.5 %. La ecuación obtenida se basó en un modelo previo que el grupo investigador propuso en 1996 para describir la retención, utilizando fases móviles micelares que contienen un co-surfactante (MLC híbrido). En general, los datos obtenidos en MELC ofrecieron un mejor ajuste del comportamiento de retención, en comparación con MLC, con errores de ajuste en el intervalo entre el 0.43 y 3.2 %. El estudio se realizó a un pH de la fase móvil ligeramente superior a 2, que se fijó con ácido trifluoroacético. Se utilizó una columna con alta tolerancia al pH (XTerra) para estos estudios, pero los resultados también son satisfactorios con fases estacionarias convencionales tamponadas a pH 3‒3.5. Al realizar el ajuste de los datos al modelo, con ayuda de la aplicación Solver de Microsoft Excel, se observó que el proceso de convergencia era problemático, ya que requería valores iniciales muy cercanos al óptimo para tener éxito. Para resolver este problema, la ecuación que describía la retención se transformó trasladando el origen a las coordenadas de la fase móvil que mostró la máxima retención (es decir, la fase con la menor fuerza eluyente). La influencia de cada modificador sobre la fuerza eluyente fue muy similar para todos los compuestos de prueba, con valores medios de 0.072, 0.119 y 0.98 para el surfactante, co-surfactante y aceite, respectivamente. Por lo tanto, el octano dio lugar a la fuerza eluyente más elevada, apreciablemente mayor que para SDS y 1 butanol. El modelo propuesto para MELC reveló que, cuando se inserta octano dentro de la micela, ésta se modifica. Por lo tanto, la interacción entre soluto y micela se modifica, como indican los valores de los parámetros del modelo, para MLC y MELC. A pesar de que la fase móvil con SDS 0.18 M, 1 % de octano y 12 % de 1-butanol mostró los mejores resultados, en términos de tiempo de análisis, tanto para los parabenos como para los antagonistas de los receptores β-adrenérgicos, la resolución sólo fue totalmente satisfactoria para los parabenos. Para los compuestos básicos, los picos de atenolol y carteolol aparecían solapados; por lo tanto, para estos compuestos resultó más adecuada una fase móvil con menor concentración de octano (0.25 %).   C) Análisis de compuestos básicos apolares en preparados farmacéuticos El trabajo realizado con los antagonistas de los receptores β-adrenérgicos (con un carácter básico y polaridad alta o intermedia) indicó la idoneidad de la MELC para el análisis de compuestos básicos. Tal como se ha explicado, el rendimiento cromatográfico de los compuestos básicos es muy deficiente en RPLC convencional, donde se obtienen largos tiempos de análisis y picos deformados, siendo el consumo de disolvente orgánico algo elevado. Los tiempos de retención en MLC con el surfactante aniónico SDS son también elevados, requiriéndose cantidades relativamente elevadas de disolvente orgánico para reducirlos. Esta situaciónn es aún más problemática para el análisis de antidepresivos tricíclicos (TCAs), que son fármacos muy utilizados en la práctica médica, con un carácter básico y elevada hidrofobicidad. Por lo tanto, se pensó que el uso de MELC podría proporcionar resultados satisfactorios en estos análisis, por lo que se implementó un método analítico para el análisis de estos fármacos en preparados farmacéuticos que contienen TCAs, utilizando MELC con una fase móvil que contenía SDS 0.173 M, 1.42 % (v/v) de octano y 8.15 % (v/v) de 1-butanol, haciendo uso de detección UV. El método mostró ventajas respecto al tiempo de análisis y consumo de disolvente orgánico. El grupo investigador se había interesado anteriormente en el control de estos compuestos en preparados farmacéuticos, para los que la RPLC convencional proporciona resultados muy insatisfactorios. El primer método publicado por el grupo data de 2003. Más tarde, en 2012, intentando mejorar estos análisis, se desarrollaron métodos en MLC con fases móviles acuosas de SDS y 1-pentanol, o de Brij-35 en ausencia de disolvente orgánico. De ahí que se decidiera llevar a cabo un estudio comparativo del comportamiento cromatográfico de los TCAs en RPLC, cuando se utilizan como fases móviles mezclas hidro-orgánicas, medios micelares y MEs. En el estudio realizado, se comparó el rendimiento analítico en términos de linealidad, exactitud y precisión intra- e inter-día. Se llevó a cabo una extensa validación, que incluyó cinco TCAs (amitriptilina, clomipramina, imipramina, maprotilina y nortriptilina) y cinco preparados farmacéuticos (cada una conteniendo un TCA), comercializados en España. Los resultados fueron muy satisfactorios, con buenas recuperaciones y una preparación de muestra muy sencilla, sin necesidad de realizar ningún pre-tratamiento más que la solubilización de la muestra y su filtración antes de su inyección. Las recuperaciones se situaron en el intervalo del 80 al 120 %, lo que se encuentra dentro de los valores tolerados para productos farmacéuticos. Por lo tanto, el método desarrollado para MELC resultó útil para el control de calidad de preparados farmacéuticos que contienen TCAs. Una ventaja del procedimiento de MELC es la reducción de los tiempos de retención, en comparación con la RPLC convencional y MLC con SDS, incluso utilizando 1-butanol como co-surfactante. El procedimiento de MELC mantiene el perfil de los picos mejorado conseguido en MLC. La validación del método se realizó de acuerdo con las directrices de la ICH (International Conference of Harmonization)y ofreció buenos resultados para los fármacos analizados. Las curvas de calibrado cumplieron los requisitos de linealidad, con coeficientes de determinación R2 > 0.990. Las pendientes y ordenadas en el origen de las curvas de calibrado, obtenidas durante tres días no consecutivos y a lo largo de tres semanas diferentes, se mantuvieron estables, lo que indicó que el rendimiento de la columna se mantuvo con una buena capacidad de predicción de las concentraciones de los analitos, a partir de las rectas de regresión ajustadas. Las precisiones intra- e inter-día siempre estuvieron por debajo del 2.5 %, y las exactitudes intra- e inter-día se situaron en los intervalos entre el -0.9 % y +1.2 %, y -1.7 % y +0.5%, respectivamente. Los límites de detección y cuantificación se situaron, para los distintos analitos, generalmente por debajo de 0.09 µg/mL y 0.31 µg/mL, respectivamente, excepto para maprotilina, que fueron 1.15 µg/mL y 3.85 µg/mL. Se evaluó también la robustez modificando el caudal y las concentraciones de SDS, octano y 1-butanol en la fase móvil. Cada uno de estos factores se varió dentro de un intervalo en torno al valor utilizado para desarrollar el procedimiento analítico, siguiendo el método OVAT (one-variable-at-a-time), donde se hacen variar los factores uno a uno, manteniendo todos los demás constantes en su valor original. La reproducibilidad (RSD) alcanzada para los tiempos de retención se situó por debajo del 2 %, correspondiendo los valores más altos a la concentración de octano, lo que confirma su importante papel en la formación de las MEs. Se obtuvo una mayor variabilidad para las áreas de los picos. Los resultados se compararon con los obtenidos con los procedimientos que utilizan fases móviles preparadas con 35 % (v/v) de acetonitrilo, SDS 0.075 M / 6 % (v/v) de 1 pentanol y Brij-35 0.02 M sin disolvente orgánico. La precisión más satisfactoria correspondió a los procedimientos de MELC y micelar con SDS y 1-pentanol, con valores generalmente por debajo del 2 %. Mientras tanto, para los modos hidro-orgánico y micelar puro con Brij-35, la precisión inter-día osciló entre el 0.65 % y 3.1 %. Los límites de detección y cuantificación fueron más bajos con el procedimiento de MELC, excepto para amitriptilina y maprotilina, para los que se obtuvieron valores más bajos con el procedimiento hidro-orgánico. D) Interacciones de los solutos en sistemas cromatográficos que utilizan surfactante y líquido iónico Idealmente, el mejor disolvente es utilizar sólo agua en ausencia de disolvente orgánico, si se consideran los peligros para la salud, la generación de residuos y la economía. Sin embargo, la ausencia de disolvente orgánico no siempre es posible. Por ello, se han propuesto disolventes más ecológicos para sustituir a los disolventes orgánicos empleados convencionalmente, con el fin de disminuir el impacto medioambiental y el riesgo de exposición química. En este sentido, los líquidos iónicos, constituidos por sales en estado líquido frecuentemente a temperatura ambiente, con un catión orgánico voluminoso asociado a un anión inorgánico u orgánico (generalmente más pequeño), han llamado mucho la atención en diversos campos científicos y tecnológicos. En el campo de la RPLC, es relevante la aparición de un artículo publicado por Peng et al. en 2017, en el que se propone el análisis de ácidos fenólicos neutros, utilizando una ME con SDS y 1-butanol, en la que se reemplaza el octano como disolvente apolar por un líquido iónico (IL, ionic liquid) inmiscible en agua (hexafluorofosfato de 1-hexil-3-metilimidazolio, [C6C1IM][PF6]). Cabe señalar que, en la bibliografía consultada, este tipo de ME suele contener un surfactante no iónico, tal como Brij-35 o Triton X-100, en lugar del surfactante aniónico SDS. Como se ha comentado, durante el trabajo de Tesis Doctoral se investigó el análisis de un grupo de fármacos básicos catiónicos (antagonistas de los receptores β adrenérgicos), utilizando una ME formada por la mezcla de SDS, octano y 1-butanol. A la vista de los resultados de Peng et al., se consideró interesante evaluar la viabilidad de este tipo de MEs preparadas con IL, para evitar el uso de octano en estos análisis. El trabajo se inició utilizando el IL [C6C1IM][PF6] para formar la ME, pero la investigación se extendió a continuación a otros ILs de imidazolio con cadenas de alquilo de diversas longitudes (n = 2, 4 y 6), asociados a los aniones Cl‒, BF4‒, o PF6‒. Estos ILs poseen diversa solubilidad y capacidad de adsorción sobre las fases estacionarias de C18, y son los más comúnmente utilizados como aditivos en las fases hidro-orgánicas utilizadas en RPLC. El estudio permitió profundizar en el conocimiento sobre el efecto del catión y anión de un IL sobre el sistema cromatográfico, en presencia de aditivos iónicos, en base al comportamiento de retención y los perfiles de pico observados para los compuestos catiónicos analizados. Los resultados se interpretaron comparándolos con los obtenidos con fases móviles que contienen IL sin SDS, y acetonitrilo en lugar de 1 butanol como disolvente orgánico. Los gráficos de retención, frente a la concentración de aditivo, mostraron que en las MEs estudiadas, el surfactante aniónico SDS compite con los aniones que forman el IL, por la adsorción sobre la columna cromatográfica. El comportamiento observado (retención decreciente al aumentar la concentración del IL) es similar al encontrado en ausencia de SDS, para ILs formados por un catión suficientemente adsorbido asociado a un anión débilmente adsorbido, como es el caso de [C6C1IM][BF4] y [C6C1IM][Cl]. Por su parte, en ausencia de SDS, un IL con un catión que muestra una baja adsorción o un anión más fuertemente adsorbido, la retención se mantiene constante o se incrementa, dando lugar a un máximo a una concentración particular de IL, que depende de su naturaleza. Sin embargo, en todas las fases móviles con IL, los perfiles de los picos de los compuestos básicos mejoraron, en comparación al uso de mezclas hidro-orgánicas en RPLC, dando lugar a picos simétricos (o casi simétricos), con un efecto más intenso en presencia de SDS. La mejora de los perfiles de pico se explica por el enmascaramiento del efecto silanol por parte de los iones de los aditivos. Cuando se reemplaza el octano por un IL, la presencia de 1-butanol es menos importante para la formación de mezclas transparentes y estables con SDS, útiles para RPLC. Además, el surfactante permite la obtención de disoluciones más concentradas de los ILs, lo que sugiere la formación de una estructura organizada de SDS / IL en la fase móvil. Puesto que el 1-butanol dio lugar a picos poco retenidos y una baja resolución para los compuestos básicos, se investigó la posibilidad de eliminarlo. En efecto, una fase móvil compuesta únicamente por el surfactante dodecilsulfato sódico (SDS) y el IL [C6C1IM][Cl] dio lugar a resultados prometedores, con perfiles de pico satisfactorios, buena resolución y retención adecuada para los compuestos estudiados. Cabe señalar que, en estas mezclas, la retención de los compuestos básicos se puede modular para alcanzar valores prácticos, modificando las concentraciones de SDS e IL, en base a la atracción de los compuestos básicos catiónicos por el anión del surfactante y la repulsión por el catión del IL, sin la necesidad de añadir un disolvente orgánico. Esto puede dar lugar a una interesante “fase móvil verde”. Se espera que el comportamiento de retención dependa de la relación de concentraciones del IL y surfactante en la fase móvil, así como de la naturaleza del IL. Debe indicarse que una fase móvil con sólo IL requiere una cierta cantidad de disolvente orgánico para obtener tiempos de análisis adecuados y la retención en fases móviles que contienen únicamente SDS es excesiva. Es de esperar que el comportamiento de retención dependa de la relación de concentraciones del IL y tensioactivo en la fase móvil, así como de la naturaleza del IL añadido. En la bibliografía, ha habido un gran interés en la síntesis de ILs con comportamiento de surfactante, en los que el catión del IL está asociado a un anión de un surfactante convencional. Se obtiene un ambiente similar en disolución acuosa con la mezcla ensayada del cloruro de alquil-imidazolio y la sal sódica de dodecilsulfato (SDS). La micela formada, posiblemente se halle compuesta por empalizadas alternas del catión del IL y anión del surfactante. Cabe señalar que no hay estudios previos publicados sobre el uso de esta combinación de aditivos en RPLC.