Understanding the dialog between the gut microbiota and the endosymbiont in the model system blattella germanica

Resumen

Esta tesis doctoral forma parte de la investigación sobre la evolución de la simbiosis en insectos realizada durante muchos años por el grupo de Genética Evolutiva de la Universidad de Valencia. El organismo modelo utilizado en este estudio es la cucaracha alemana, Blattella germanica, un insecto omnívoro y cosmopolita. La cucaracha alemana posee dos simbiontes: un endosimbionte, Blattabacterium, y una compleja microbiota intestinal. La función del endosimbionte ha sido propuesta previamente como la producción de metabolitos esenciales mediante el reciclaje del nitrógeno a través de la vía ureolítica. Esta cucaracha comparte la fuente de alimento y el ambiente con los humanos, lo que podría explicar las similitudes de la estructura de su microbiota intestinal con la humana. Esta información lo convierte en un organismo interesante para estudiar tanto los mecanismos evolutivos después de la obtención de dos simbiontes complejos, como el estudio de su microbiota intestinal como modelo para estudiar el humano. Con respecto a nuestro estudio, el objetivo principal de la tesis es entender por qué las cucarachas tienen dos sistemas simbióticos (Blattabacterium y la compleja microbiota intestinal) y si hay un "diálogo" entre ellos y el anfitrión. Para conseguirlo, hemos propuesto tres objetivos específicos. Analizar mediante ensayos de complementación funcional en levaduras si los transportadores supuestos codificados en el genoma del Blattabacterium (es decir, gltP y glpF) son capaces de facilitar la entrada de glutamina y urea al endosimbionte, analizar la comunicación entre el endosimbionte y la microbiota intestinal estudiando los cambios en los dos sistemas simbióticos por efecto de un estrés (tratamiento antibiótico), y analizar mediante estudios meta-ómicos de la microbiota intestinal en tres niveles diferentes (metagenómica, metatranscriptómica y metaproteómica) y desarrollando una canalización para interpretar e integrar los resultados de estos análisis. Con el fin de estudiar los transportadores que permiten la interconexión metabólica entre el endosimbionte y el hospedador, hicimos clonar y probar las proteínas transportadoras propuestas en levadura y realizamos ensayos de complementación funcional para estudiar su función. Las proteínas deben situarse en la interfaz de membranas entre el endosimbionte (Blattabacterium) y el hospedador (bacteriocitos). Estas proteínas fueron seleccionadas tras el análisis del genoma del endosimbionte: las proteínas GlpF y GltP fueron escogidas como opciones más plausibles por su estructura y propiedades químicas. En este experimento se analizaron las capacidades de transporte, su ubicación subcelular y niveles de transcripción y traducción de las proteínas clonadas en levaduras. Para estudiar la comunicación entre el endosimbionte y la microbiota intestinal, hemos realizado un estudio en el que evaluamos los efectos de un tratamiento con antibióticos (rifampicina) sobre la población de endosimbiontes, la estructura de la microbiota intestinal y la eficacia biológica del hospedador. La rifampicina es capaz de reducir la población del endosimbionte cuando se encuentra extracelularmente durante la infección de los ovarios, el mecanismo que usa para transmitirse verticalmente. Tratamos las cucarachas con rifampicina para obtener organismos aposimbiontes y estudiamos los efectos de esta reducción sobre la estructura de la microbiota intestinal analizada mediante la secuenciación del gen 16S rRNA, y los efectos sobre el huésped midiendo diversos parámetros de eficacia biológica: peso, fecundidad, mortalidad y velocidad de desarrollo. El estudio de múltiples datos meta-ómicos y el desarrollo un programa para integrar estos datos se desarrolló junto con la Unidad de Bioinformática del Instituto Robert Koch (Berlín, Alemania). El programa se llamó gNOMO, ya que está diseñado específicamente para analizar la microbiota de organismos no modelo y la información del hospedador en paralelo. Este programa incluye el análisis de tres técnicas de meta-ómicas: metagenómica, metatranscriptómica y metaproteómica, y su integración, tanto para la microbiota como para los datos del hospedador. Su diseño y flujo de trabajo se explican completamente y también se incluyen los resultados biológicos de interés obtenidos de estos análisis: muestras de la microbiota intestinal en dos puntos temporales de la etapa adulta de las cucarachas en situación de control para describir la microbiota intestinal y entender su función.