Vesículas extracelulares de trypanosoma cruzicaracterización estructural, proteómica y estudio de los cambios fisiológicos inducidos en células

Résumé

La enfermedad de Chagas o tripanosomiasis americana es una enfermedad causada por Trypanosoma cruzi, un protozoo intracelular obligado en el hospedador mamífero y con un ciclo de vida donde interviene un insecto hematófago vector y el hospedador mamífero. Esta enfermedad se caracteriza por presentar una fase aguda y una fase crónica, con variaciones en la sintomatología y la patología entre los individuos infectados. El proceso patogénico en la enfermedad de Chagas es complejo y multifactorial e involucra la participación de respuestas conjuntas y a veces sinérgicas, tanto del parásito como de la célula hospedadora, entre las que se involucran las vesículas extracelulares o exovesículas (VEs). Hasta la fecha existen publicaciones que demuestran la participación de las VEs de T. cruzi en la comunicación intercelular, la patogénesis de la enfermedad y la evasión de la respuesta inmune y se ha comprobado su papel en el incremento de parasitación celular y en la adhesión e invasión del parásito en las células hospedadoras. Sin embargo, existe muy poca información sobre la forma en la que las VEs del parásito condicionan la fisiología celular para permitir y favorecer la entrada del parásito a la célula y permitir su sobrevivencia y multiplicación intracelular o las alteraciones que desencadenan las diferentes patologías de la enfermedad de Chagas. En esta Tesis Doctoral se ha realizado el aislamiento mediante centrifugación diferencial de las VEs a partir de cultivos de tripomastigotes de T. cruzi de la cepa Pan4, caracterizándose dichas exovesículas mediante diferentes técnicas como microscopía electrónica, “nanoparticle tracking analysis” y “dynamic light scattering”. Se ha analizado la interacción de dichas VEs con los cultivos celulares para evidenciar el incremento en los porcentajes de parasitación generado por estas vesículas, comprobándose que el efecto sobre las células es específico para el parásito y que dichos efectos son temporales en las células con las que interaccionan. Por otra parte, se ha estudiado el papel de las exovesículas de T. cruzi Pan4 en diferentes procesos celulares como la inducción de una permeabilización celular, la inducción de la movilización intracelular de calcio, la generación de cambios en el citoesqueleto celular, su efecto sobre el ciclo celular y sobre la apoptosis. Dado que se observaron cambios en estos procesos celulares, se evaluó de manera general la participación de las proteínas Rho GTPasas y el efecto que las vesículas ejercen sobre dichas proteínas. Además, se han determinado las propiedades nanomecánicas de dichas VEs, comparándolas con las propiedades de los inmunocomplejos formados in vitro de estas vesículas con IgGs anti-T. cruzi, estudios llevados a cabo mediante microscopía de fuerza atómica. De igual manera, se ha pretendido investigar la biodistribución de las VEs y de los inmunocomplejos que forman, tras su inoculación y seguimiento por IVIS en un modelo animal. Por último, se ha llevado a cabo un estudio comparativo del proteoma de las VEs procedentes de los tripomastigotes y epimastigotes de la cepa Pan4 de T. cruzi, con el fin de analizar el “cargo” de proteínas de las VEs de cada fase del parásito. De los resultados obtenidos de la presente Tesis Doctoral se desprende que la incubación de las células con las VEs de las formas tripomastigotas infectivas de una cepa DTU I de T. cruzi produjo cambios importantes en las células, entre los que destacan el cambio en la permeabilidad celular, el incremento de los niveles de calcio intracelular que altera la dinámica del citoesqueleto celular y el ciclo celular. Además, las VEs del parásito fueron capaces de generar un efecto “protector” frente a la apotosis celular, ya que se obtuvieron valores más bajos de apoptosis temprana y tardía en aquellas células incubadas con estas vesículas. Además, disminuyeron los niveles de expresión de los genes RhoA, Rac1 y Cdc42 cuando las células fueron incubadas con las VEs del parásito. Los análisis mediante microscopía de fuerza atómica revelaron detalles de la estructura de las VEs y de los inmunocomplejos, así como diferencias en propiedades mecánicas como la adhesión, rigidez y módulo de Young. En el caso de la biodistribución, cabe resaltar la presencia de las VEs al cabo del tiempo en órganos como el hígado y el bazo, mientras que cuando se usaron los inmunocomplejos formados por estas VEs se pudieron localizar también en el tracto digestivo. Por último, la comparación del proteoma entre las VEs de tripomastigotes y epimastigotes reveló la presencia de una mayor cantidad de proteínas en las VEs de las formas tripomastigotes infectivas, así como una cantidad significativamente mayor de las enzimas pertenecientes a la familia de las trans-sialidasas, proteínas claves durante el proceso de invasión del parásito.