Síntesis y caracterización de poliaminoescuaramidasestudios de agregación y actividad biológica

Résumé

La terapia génica persigue tratar enfermedades y desórdenes de origen genético. Una extensión trascendente de la terapia génica es la corrección génica que se logra usando sistemas de tipo CRISPR/Cas9. En esencia, ambas técnicas se basan en la inserción de material genético exógeno a nivel celular con el fin de modificar la correspondiente expresión proteica. Aunque el potencial de desarrollo de las terapias génicas es enorme, existen obstáculos importantes que impiden un uso clínico habitual de dichas terapias. Entre estos, son particularmente importantes los riesgos asociados a la bioseguridad y a la falta de efectividad de los tratamientos. A nivel experimental, la inserción celular de cualquier tipo de ADN requiere la utilización de vectores de transfección. En esta labor, se utilizan vectores virales que poseen elevada efectividad, pero introducen riesgos biológicos. Como alternativa, se están desarrollando vectores de tipo químico (objetivo de la tesis) que, en general, presentan un menor riesgo biológico, pero cuya efectividad es limitada. En primer lugar, se introduce al lector sobre las características estructurales de las escuaramidas, su capacidad de interacción con otras moléculas y las aplicaciones que surgen en diversos campos. En el capítulo 3, se describen los experimentos realizados sobre un oligómero cíclico de dos unidades escuaramida (MC2). Aunque los experimentos previos a la Tesis parecían indicar que este compuesto podía presentar actividad transfectiva, el estudio recogido en esta Memoria, ha descartado cualquier tipo de actividad en este sentido. El compuesto MC2, del que se ha logrado su estructura de rayos X, puede presentar varias conformaciones. Se describe también la síntesis de una variante de MC2 soluble en disolventes apolares. El estudio realizado, en base a múltiples experimentos UV-Vis y RMN a temperatura y concentración variables, ha permitido descubrir hasta tres tipos de agregación y se ha demostrado la compleja interrelación que existe entre los distintos estados agregados. El capítulo 4 profundiza en la idea inicial, en el sentido de que las oligoescuaramidas cíclicas podrían poseer actividad transfectiva, describiendo la síntesis de oligoescuaramidas cíclicas de una a ocho unidades escuaramida (MC1-MC8). Los cromatogramas GPC prueban la pureza de los oligómeros MC1 a MC4, pero al mismo tiempo han permitido descubrir que los macrociclos superiores (MC5 a MC8) contienen proporciones variables de otros oligómeros y detectar la formación de un material desconocido de elevado peso molecular. La evaluación de la actividad transfectiva de la serie indica cierta actividad transfectiva asociada a MC7 y MC8. En ningún caso se observa toxicidad celular reseñable. En el capítulo 5, se plantea directamente qué polímeros de base escuaramida podrían ser responsables de la transfección. En este capítulo se describen varios procedimientos para la síntesis de polímeros de tipo poliaminoescuaramida (pASQUA) y su separación mediante precipitación fraccionada o mediante filtración centrífuga fraccional. Se ha caracterizado el material y se ha evaluado la actividad biológica del material responsable de la transfección. El capítulo 6 se encuentra en la interfase de la química y la biología; donde se estudia la interacción pASQUA::ADN utilizando plásmidos y otros ácidos nucleicos. Se describen imágenes de los poliplejos obtenidas por AFM combinadas con mediciones de potencial zeta y diámetro hidrodinámico. Todo ello junto con los experimentos de desplazamiento de indicadores fluorescentes (FID) y siempre con la evaluación biológica ha demostrado la elevada capacidad de transfección de los polímeros pASQUA. Algunos experimentos de transfección sobre organismos unicelulares realizados con éxito con pASQUA incluyen: protistas unicelulares (T. cruzi) formas epimastigote y amastigote. Monocercomonides (para los que no existe ningún método efectivo de transfección). Transformación extracelular de bacterias (Mycobacterium tuberculosis). Transformación intracelular de bacterias (Rickettsia canadensis y Orientia tsutsugamushi) en células VERO. Transfecciones sobre líneas celulares inmortalizadas (HEK293; PC-3; SW480) y cultivos primarios.