Estrategias de mejora en microscopía por iluminación o colección estructurada

Abstract

Existen dos límites que nos impone la naturaleza ondulatoria de la luz y que no seremos capaces de sobrepasar con las técnicas proporcionadas por la microscopía convencional: la resolución predicha por la difracción y la capacidad de seccionado óptico. En este trabajo se han estudiado las propiedades ópticas de distintos sistemas de microscopía manipulando convenientemente el modo en el que se ilumina la muestra o en el que se registra la luz que parte de la misma. Este amplio estudio ha llevado al conocimiento necesario para realizar modificaciones de algunas técnicas en algún caso, o la invención de nuevas técnicas en otros casos, para la mejora de estas propiedades ópticas. En primer lugar, presentamos la microscopía convencional, presentando las propiedades ópticas y limitaciones que presentan estos sistemas formadores de imágenes, como son el límite de resolución, la ausencia de seccionado óptico y la velocidad de procesamiento, con el fin de incorporar nuevas alternativas que mejoren estas limitaciones. A continuación, se presenta la descripción de la técnica principal de estudio, la microscopía por iluminación estructurada. Inicialmente, detallaremos la técnica tal cual es utilizada por la comunidad científica en la mayor parte de los casos. Recopilaremos todo el proceso de esta técnica desde la iluminación hasta la captura, describiendo con detalle todas sus virtudes e inconvenientes. Veremos cómo una estimación errónea del desplazamiento del patrón de iluminación se transforma en una interpretación equivocada con la consecuente reconstrucción defectuosa de la información tridimensional de la muestra. En este punto introduciremos una nueva técnica con la que hemos conseguido estimar de forma precisa el desplazamiento del patrón de iluminación. Otro de los inconvenientes prácticos de la técnica está relacionada con la variación del contraste del patrón de iluminación tridimensional. Para minimizar este efecto se abordar el diseño de un montaje óptimo del sistema óptico para maximizar el contraste del patrón de iluminación. Por último, tras una revisión profunda de este tipo de sistemas de iluminación y captura, desarrollamos una nueva técnica de microscopía basado en los principios físicos de las técnicas microscopía por iluminación estructurada y confocal que puede llegar a sustituirlas en el desarrollo de la investigación científica por su potencialidad y mejora de las propiedades ópticas alcanzables por estas técnicas. Esta nueva técnica es capaz de conseguir duplicar la resolución de un sistema óptico convencional y obtener seccionado óptico de la muestra simultáneamente, algo inalcanzable con las técnicas existentes hoy en día. Es tal la potencialidad de esta nueva técnica, a la que hemos llamado microscopía por Iluminación estructurada escaneada, que a día de hoy se encuentra en las últimas fases del proceso de patente.