Estudio del papel de la emt y las vías de control inmunológico en las micrometástasis moleculares detectadas en ganglio centinela de pacientes con carcinoma bronco pulmonar en estado temprano

Resumen

RESUMEN TESIS DOCTORAL INTRODUCCIÓN En los últimos años se ha incrementado el uso de técnicas de biología molecular para mejorar el diagnóstico y conocer mejor la etiología del CP (cáncer pulmonar), debido a que la posibilidad de padecerlo ha sido definida como la interrelación entre la exposición a carcinógenos ambientales y la susceptibilidad individual determinada genéticamente (D’Amico et al., 1999). Dicha susceptibilidad genética es la que resulta determinante para entender por qué, siendo el tabaco responsable de más del 90% de los CP en el hombre y del 80% en la mujer, sólo un 11-12% de los fumadores desarrollan un cáncer (Kratz et al., 2012). Sin embargo, comprender qué factores genéticos determinan una mayor propensión a desarrollar un CP es una tarea compleja. Estudios previos han mostrado que el riesgo genético está determinado por numerosos polimorfismos, cada uno de ellos de baja penetrancia (estimada en un 1% de la población general). Cuando varios de estos polimorfismos coinciden en un individuo concreto definen el riesgo cuantitativo, aunque siempre en relación con la dosis de exposición a los carcinógenos (Wheatley-Price et al., 2008). Además, por el momento tampoco se conoce bien el agrupamiento genético que pueda definir el riesgo de cada tipo de CP (Mok et al., 2009). Existen diversos factores pronósticos, sobre todo de tipo morfológico y molecular, que pueden condicionar la supervivencia de las distintas formas de cáncer y que no se tienen en cuenta en la clasificación TNM. En el CP la utilidad del sistema TNM también ha sido cuestionada, ya que no logra configurar grupos de pacientes con un pronóstico homogéneo, sobre todo en estadios precoces. La afectación metastásica a nivel ganglionar es el principal factor pronóstico en el carcinoma pulmonar localizado, habiéndose relacionado recientemente la activación aberrante de la transición epitelio - mesenquimal (EMT) con la conversión de un carcinoma no invasivo en un tumor de características metastásicas y de mal pronóstico. De hecho la EMT ha sido establecido como uno de los principales factores en la progresión del cáncer, la diseminación linfática y la aparición de metástais. Durante este proceso, las células pierden la expresión de marcadores epiteliales (como E-Cadherina) e incrementa la expresión de marcadores mesenquimales (como Vimentina o N-Cadherina). Dado que la micrometástasis por sí solas no se relacionan con el pronóstico pero si que muestran un 20% de recidivas, el análisis de las vias de EMT y sobretodo del papel del sistema inmune nos podría ayudar a diferenciar esas micrometástasis que van a progresar de las que no lo van a hacer. Una evaluación de la expresión de los marcadores de EMT en las micrometástasis moleculares localizadas en el ganglio centinela de pacientes con carcinoma pulmonar permitiría avanzar en el conocimiento de los procesos moleculares implicados en la metástasis durante la enfermedad. Por otro lado, un estudio paralelo de los niveles de expresión de los marcadores de las diferentes vías de control inmunológico y de las células inmunitarias infiltradas en el tejido tumoral pulmonar y en ganglio centinela de estos pacientes contribuiría a obtener información sobre nuevas dianas moleculares susceptibles de ser bloqueadas mediante inmunoterapia. MATERIAL Y MÉTODOS En el estudio se incluyeron pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas (CPCNP) para los cuales se programó cirugía para su tratamiento. Como paso preoperatorio, se realizó una estadificación rutinaria. Durante la cirugía se realizó un muestreo sistemático de los ganglios linfáticos en todos los pacientes. Tras la resección pulmonar, las muestras quirúrgicas (tumor primario y ganglios linfáticos) fueron evaluadas inmediatamente por un patólogo y se llevó a cabo la clasificación histopatológica de rutina y la estadificación patológica del tumor de acuerdo con las Revisiones en el Sistema Internacional para la Estadificación del Cáncer de Pulmón (Hsu et al., 2009). Se diseñó un estudio observacional longitudinal prospectivo no probabilístico de tipo consecutivo de entre aquellos sujetos que cumplían los criterios de inclusión. Para analizar las variables como categóricas, los valores de expresión génica en tumor se clasificaron, en comparación con los tejidos normales adyacentes, como altos (>1) o bajos (<1). Para determinar la relación epitelio/mesénquima de las muestras, se calcularon las relaciones CDH1/CDH2 y CDH1/VIM. El coeficiente de correlación de Spearman (r) se utilizó para medir las correlaciones entre los niveles de expresión génica en los tejidos tumorales y el ganglio centinela. Para analizar la supervivencia libre de enfermedad (SLE) y la supervivencia general (SG) se usó la prueba de Kaplan-Meier. RESULTADOS Atendiendo a los criterios de inclusión y exclusión el estudio se llevó a cabo en un total de 101 pacientes. El 56,44% de los pacientes eran mayores de 65 años y el grupo más frecuente fue el de los hombres (80,20%). Además, la mayoría de los casos presentaron un adenocarcinoma (61,39%) en estadio I (70,30%), con grado de diferenciación I (39,60%). Para estudiar la presencia de micrometástasis moleculares en el GC (ganglio centinela) analizamos la expresión de tres marcadores: CK7, CEACAM5 y BPIFA1. En nuestra serie de pacientes, solo pudimos realizar la determinación molecular en 96 (95,05%) de ellos. De todos ellos, 60 (62,50%) presentaron presencia de micrometástasis molecular en GC. Por otra parte, calculamos las ratios CDH1/CDH2 y CDH1/VIM, con el objetivo de determinar si el fenotipo era más epitelial o mesenquimal. En nuestra serie de pacientes, observamos una menor SG de aquellos que presentaron un resultado positivo de micrometástasis determinada por IHQ (p=0,023). Cuando analizamos la SLE, no observamos diferencias significativas en función de la micrometástasis (p>0,05). Por otra parte, también determinamos la presencia de micrometástasis en GC mediante IHQ, detectando la expresión de CK7 a nivel proteico en secciones de muestras incluidas en parafina. Es importante destacar que el 54% de las muestras con resultado negativo mediante IHQ resultaron ser positivas mediante qPCR, lo que podría explicarse por la mayor sensibilidad de la PCR respecto a la IHQ. Por el contrario, el 40% de muestras positivas por IHQ obtuvo un resultado negativo mediante qPCR, probablemente atribuible a la falta de células que expresan dicho marcador en la muestra de GC a analizar. Tampoco podemos obviar que, a pesar de las diferencias entre las dos técnicas, observamos que la presencia micrometástasis detectada por qPCR no influye en la supervivencia de los pacientes. En nuestro trabajo no encontramos diferencias en la expresión de marcadores de EMT entre los tumores de los pacientes con micrometástasis en GC detectada mediante qPCR y los que no la presentaban. Del mismo modo, no encontramos diferencias en la expresión de CDH1 y CDH2 en tumores primarios con micrometástasis detectada por IHQ, aunque sí observamos una mayor expresión de SNAI1, VIM, ZEB1 y ZEB2. Por otra parte, en el análisis del estado molecular de la EMT del GC, observamos que la micrometástasis por qPCR e IHQ se relacionó con una alta expresión de CDH2 y un mayor número de pacientes con alta expresión de VIM. En cuanto al valor pronóstico, el análisis de supervivencia mostró un peor pronóstico en los pacientes con una baja ratio CDH1/CDH2 en GC (tanto SLE como SG). DISCUSIÓN Con todo, nuestros datos sugieren que la expresión de marcadores de EMT en GC se podría utilizar para mejorar la clasificación de los pacientes y predecir un pronóstico para los pacientes en estadio temprano de CP. Este análisis complementaría la evaluación histopatológica para estudiar la micrometástasis mediante métodos moleculares con mayor profundidad y así detectar aquellos pacientes de CP en estadio temprano que recaen pero que no son detectados mediante los análisis histopatológicos rutinarios. Por esto, pensamos que el estudio de la expresión de los marcadores de las diferentes vías de control inmunológico en el tumor y GC de los pacientes podría contribuir a identificar nuevas dianas susceptibles de ser bloqueadas mediante inmunoterapia. Además, la relación de la expresión de estos marcadores con las características clínico-patológicas de los pacientes podría ofrecer una mejor clasificación de la enfermedad y una mejora en la elección del tratamiento. En un primer análisis de los marcadores del sistema inmunitario en tejido tumoral, encontramos que alrededor del 60% de los pacientes mostraron una alta expresión de CD137 y GITR, mientras que menos del 20% mostraron una alta expresión de PD-1 y PD-L1. De todos los marcadores estudiados, únicamente CD27 y CD137 aparecieron en mayor frecuencia en los pacientes con micrometástasis positiva por qPCR. Por otra parte, el estudio mostró valores más altos de expresión de los marcadores CD27, CD28 y CD40 en los tumores de pacientes con un resultado positivo de micrometástasis por qPCR. La señalización mediante CD27 tiene un papel inmunitario importante y se podría usar como terapia antitumoral ya que se ha visto que linfocitos infiltrados en el tumor sólido expresan CD27 (Starzer y Berghoff, 2020). El análisis de supervivencia mostró una menor SG de los pacientes con baja expresión de CD27 en tejido tumoral. Además, aquellos con una alta expresión de KIR, PD-1 y PD-L1 también mostraron menor supervivencia, en este caso SLE. En cuanto al GC, observamos que un mayor número de pacientes con micrometástasis positiva por qPCR presentaba una alta expresión de los marcadores CD137 y LAG-3 y en el análisis de expresión de los marcadores del sistema inmunitario observamos que los pacientes con un resultado positivo de micrometástasis por qPCR mostraron mayores niveles de expresión de CD40, KIR, OX-40 y PD-L2. Como conclusión diremos que el estudio del perfil de expresión de los marcadores del sistema inmunitario nos permite establecer un mejor pronóstico y clasificación del paciente con el objetivo de mejorar el tratamiento con imnunoterapia.