Inhibidores de la quinasa del ciclo de división celular 7 (CDC7) para el tratamiento de la esclerosis lateral amiotrófica.

Resumen

El aumento de la esperanza de vida de los seres humanos ha supuesto un aumento en el número de casos de enfermedades asociadas al envejecimiento, como es el caso de las enfermedades neurodegenerativas. El tratamiento de este tipo de enfermedades, para los cuales no existe una terapia eficaz, supone uno de los grandes retos de la sociedad actual. Entre las enfermedades neurodegenerativas más importantes se encuentra la esclerosis lateral amiotrófica (ELA), considerada la enfermedad de las motoneuronas más frecuente y grave en adultos. La edad de aparición de los primeros síntomas se encuentra comprendida entre los 55 y los 69 años y, en casi todos los casos, la esperanza de vida media de los pacientes suele ser de 2 a 5 años tras el diagnóstico. Aunque su etiología es desconocida, se conocen diferentes mecanismos biológicos asociados con el desarrollo de la enfermedad, como la excitotoxicidad por glutamato, el estrés oxidativo, la neuroinflamación o la agregación de proteínas, siendo esta última uno de los rasgos más característicos de la enfermedad. Entre las diferentes modificaciones post-traduccionales que sufren las proteínas y que provocan su agregación y acumulación en el citoplasma celular, la fosforilación es una de las más relevantes. Existen diferentes proteínas quinasas implicadas en la fosforilación de proteínas implicadas en la neurodegeneración. Una de ellas es la quinasa del ciclo de división celular 7 (CDC7). CDC7 es una serina/treonina quinasa de localización principalmente nuclear esencial para la replicación del ADN y la progresión del ciclo de división celular en las células eucariotas. Debido a este papel importante en el ciclo celular, se convirtió en una diana terapéutica muy estudiada para el tratamiento de diferentes tipos de tumores, dando lugar al desarrollo de varios inhibidores en fases clínicas y pre-clínicas. Además de ser una quinasa muy importante para la replicación celular, está involucrada en la fosforilación patológica de TDP-43, una de las proteínas más abundantes en los agregados encontrados en los pacientes de ELA. Teniendo en cuenta estos antecedentes, en este trabajo de tesis doctoral nos planteamos, como objetivo principal, la búsqueda de nuevos inhibidores de CDC7 como estrategia novedosa para el tratamiento de la ELA y de otras proteinopatías de TDP-43. Para ello, llevamos a cabo diferentes estrategias. En primer lugar, se prepararon y caracterizaron nanopartículas poliméricas como sistemas de liberación de fármacos para mejorar la permeabilidad del PHA-767491 a través de la barrera hematoencefálica. El compuesto PHA-767491 es uno de los primeros inhibidores de CDC7 descritos en la literatura. Este potente inhibidor con gran actividad antitumoral en diferentes líneas celulares tumorales es el único inhibidor de CDC7 conocido capaz de modular la fosforilación patológica de TDP-43 in vitro. Sin embargo, no es capaz de penetrar en el sistema nervioso central. Así, mediante el uso de partículas poliméricas de tamaño submicrónico, conseguimos mejorar la permeabilidad celular de este compuesto, convirtiéndose en una estrategia prometedora para el desarrollo del PHA-767491 como candidato a fármaco para el tratamiento de la ELA. Por otro lado, se diseñaron y sintetizaron nuevos inhibidores de CDC7 siguiendo un enfoque de genética química inversa. Esta metodología, basada en la identificación de moléculas pequeñas que interaccionan con una diana conocida, dio lugar a la identificación de un prototipo inicial a partir del cual se realizaron diferentes modificaciones estructurales, obteniéndose una nueva familia de compuestos con actividad inhibitoria en CDC7 en el rango submicromolar. Estos compuestos, derivados de 6-mercaptopurina, fueron caracterizados como inhibidores ATP-competitivos, selectivos en un panel de más de 40 quinasas y permeables a la barrera hematoencefálica. Además, los mejores candidatos fueron evaluados en diferentes modelos celulares y animales de ELA. En estos modelos, se observó que los compuestos seleccionados eran capaces de reducir la fosforilación patológica de TDP-43, prevenir su acumulación en el citoplasma celular y reducir la muerte neuronal de los animales tratados. Estos resultados confirman que CDC7 puede ser una diana farmacológica interesante para el tratamiento de la ELA, teniendo un candidato muy avanzado para la futura transferencia de resultados. En tercer lugar, y dado el potencial terapéutico mostrado para los inhibidores de CDC7, se llevó a cabo la búsqueda de moduladores alostéricos de esta quinasa. Puesto que el sitio catalítico de las proteínas quinasas se encuentra bastante conservado entre las diferentes quinasas que componen el quinoma humano, muchos inhibidores ATP-competitivos son pocos selectivos frente a la diana de interés. Es por ello que la búsqueda de pequeñas moléculas capaces de unirse a alguna cavidad diferente del sitio de unión del ATP constituiría una alternativa a este problema. Gracias a la existencia de diferentes estructuras cristalográficas de CDC7, se identificaron inicialmente varios bolsillos conservados en la superficie de todas las estructuras de esta quinasa como posibles bolsillos alostéricos potencialmente accesibles por moléculas pequeñas empleando diferentes técnicas computacionales. Después, se realizó un cribado virtual de compuestos sobre dos de los bolsillos identificados, seleccionándose varios compuestos estructuralmente diversos para futuros estudios. Por último, dada la importancia de los compuestos multidiana para el tratamiento de enfermedades complejas como la ELA, se diseñaron y sintetizaron fármacos capaces de inhibir dos dianas farmacológicas de forma simultánea. Teniendo en cuenta que otra de las proteínas quinasas implicadas en la fosforilación patológica de TDP-43 en los pacientes de ELA es la caseína kinasa-1delta (CK-1delta), se decidió diseñar y sintetizar fármacos inhibidores duales de CDC7 y CK-1delta. De esta forma, y haciendo uso de la cicloadición de Huisgen 1,3-dipolar entre una azida y un alquino terminal, se obtuvieron diferentes triazoles 1,4-disustituídos con actividad inhibitoria en ambas quinasas, los cuales representan una nueva familia de compuestos con potencial farmacológico para el desarrollo de terapias más eficaces para la ELA. Estas diferentes aproximaciones ofrecen nuevas oportunidades para el desarrollo de nuevas terapias para el tratamiento de la ELA y de otras enfermedades neurodegenerativas donde TDP-43 se encuentra involucrada, resaltando el papel importante de CDC7 como diana farmacológica para las TDP-43-patías.