Estudio de la expresión de genes relacionados con la hepatoprotección polaridad e uniones estrechas entre hepatocitos y matriz extracelular, responsables de la normal arquitectura hepática, en animales con deficiencia parcial de Insulin-like Growth Factor-1 (IGF-1) / Víctor Javier Lara Díaz; [directoras Inma Castilla de Cortázar Larrea y Úrsula Muñoz Morón].

Abstract

Estudio de la expresión de genes dependientes de Insulin-like Growth Factor tipo 1 (IGF-1) relacionados con hepatoprotección, polaridad e uniones estrechas entre hepatocitos y matriz extracelular, responsables de la normal arquitectura hepática, en animales con deficiencia parcial de IGF-1, de Víctor Javier Lara Díaz. Introducción: El factor de crecimiento semejante a la insulina tipo 1 (IGF-1) es una hormona polipeptídica de 71 aminoácidos que se sintetiza principalmente en el hígado, por el estímulo endócrino de la hormona de crecimiento (GH) y con acciones en multitud de órganos y sistemas. IGF-1 ejerce su actividad como mediador de la GH de forma particularmente clara en la etapa del crecimiento infantil, siendo fundamental su papel en las diferentes fases de la vida, y de modo especialmente relevante durante el envejecimiento y cuando se incrementa el daño oxidativo. El carácter sistémico de la expresión y la actividad de IGF-1, pone de manifiesto su importancia. Su acción es dependiente de la unión a receptores de membrana específicos, que se encuentran en la mayoría de los tipos celulares. Aunque el hígado es la principal fuente fisiológica de IGF-1, en condiciones normales no es un órgano diana de IGF-1: de hecho, los hepatocitos no expresan receptores para IGF-1. Nuestro grupo de investigación ha demostrado que la administración exógena de dosis bajas de IGF-1, en la cirrosis hepática y en el envejecimiento (ambos estados de deficiencia de IGF-1) induce efectos hepato-protectores, con mejoría de la función mitocondrial y del metabolismo hidrocarbonado y lipídico. Objetivos, material y métodos: El objeto del presente trabajo consistió en profundizar en el conocimiento de los efectos de la deficiencia parcial de IGF-1 en el desarrollo y función hepáticos. Para ello utilizamos un nuevo modelo experimental, recientemente caracterizado por nuestro grupo de investigación. De este modo, fue posible discernir los efectos de la mera deficiencia de IGF-1 sobre: 1. La expresión de genes que codifican para proteínas con efectos antioxidantes, proinflamatorios, antiinflamatorios y/o citoprotectores. 2. La expresión de genes implicados en el desarrollo de la correcta arquitectura del parénquima hepático: diferenciación, morfogénesis, uniones intercelulares, polaridad celular, etc. 3. La expresión de genes que codifican para proteínas involucradas en la señalización, captación y transporte de IGF-1. El protocolo experimental incluyó tres grupos de animales de 25 semanas de edad: 1) Controles wild type (CO, Igf-1+/+), n=10; 2) Heterocigotos con una sola copia funcional del gen igf-1 y con concentraciones circulantes de IGF-1 significativamente reducidas (Hz, Igf-1+/-), n =10; y 3) Heterocigotos que fueron tratados con dosis bajas de rhIGF-1 (2 microg/100 g de peso corporal/día, s.c., durante 10 días (Hz+IGF-1), n=10. Se analizaron por micro-arrays, con posterior confirmación por PCR cuantitativa, los genes que codifican para las proteínas que son objeto del presente trabajo, en los tres grupos experimentales, y así pudimos determinar las cambios en el patrón de expresión, tanto los ocasionados por la sola deficiencia parcial de IGF-1 (Hz, Igf-1+/-) frente a los controles (CO, Igf-1+/+), como tras la terapia sustitutiva con esta hormona (Hz+IGF-1). Se analizaron las características histológicas hepáticas con métodos convencionales. En un segundo momento, se estudiarán las potenciales vías implicadas, y los promotores susceptibles de estar relacionados con el silenciamiento o la hiperexpresión génica, así como las características histológicas con inmunohistoquímica. Resultados: La concentración circulante de IGF-1, el peso corporal y el peso hepático absoluto fueron significativamente menores en el grupo Hz comparado con el CO. El estudio histológico convencional demostró una disposición anormal de los cordones hepatocitarios. Aunque en este protocolo los sujetos experimentales no sufrieron ningún tipo de agresión oxidativa ni proinflamatoria, se observó una concentración marcadamente elevada de Malondialdehido, así como una hiperexpresión de los genes cat, c1qa, c1qb, ccl6, ccr5, csf1r, il10rb, ly96, lyz2, saa1, y spp1, Hz vs CO. En cuanto a los genes que codifican para proteínas implicadas en la apoptosis y heat shock proteins, se observó hipoexpresión de los genes gadd45a, hspa13, hspa1b y hspa8, así como hiperexpresión significativa de aif1 y apaf1. En todos estos parámetros, excepto c1qa y c1qb, el tratamiento sustitutivo logró normalizar sus valores. Respecto a los genes relacionados con IGF-1, su receptor y sus proteínas transportadoras, en el grupo Hz comparado contra CO se apreció hipoexpresión de los genes igf1, igfbp1, igfbp3, igfbp5 e igfbp8 así como hiperexpresión del gen igf1r. El tratamiento sustitutivo normalizó la expresión del gen igf1 y de su receptor, pero no tuvo efecto sobre los genes de las proteínas transportadoras. En cuanto a los genes de las rutas de señalización de IGF-1 en hígado, se confirmó hipoexpresión de fos, grb2 y jun, así como una tendencia a la hiperexpresión de nras. El tratamiento sustitutivo normalizó la expresión de los tres primeros, pero no tuvo efecto alguno sobre nras. Al examinar los genes relacionados con el citoesqueleto, uniones estrechas, uniones adherentes y desmosomas en hígado, observamos hipoexpresión de los genes actb, tub2a, vcl, mark2, spna2 y stk1; e hiperexpresión de los genes cdh5, cldn1, cldn7, cldn14, dsc2, jam2, myosin1b y vim. En el caso de actb, tub2a, vcl, mark2 y stk1, hipoexpresados, y de cdh5, cldn1, cldn7, cldn14, dsc2, jam2, myosin1b y vim, hiperexpresados, el tratamiento sustitutivo normalizó los valores de expresión, mientras que no se observó efecto alguno sobre la expresión de los genes de spna2, cdh1 y dsc2. De los genes que codifican para proteínas de la matriz extracelular, confirmamos hipoexpresión del gen itgb2 y su normalización tras el tratamiento sustitutivo. En el microarray se detectó además hipoexpresión del gen col1a2, e hiperexpresión de los genes col5a2, fn1, hapln2 y prg4. No fue posible por razones presupuestales confirmar o descartar este último grupo. Conclusiones: Los animales Hz Igf-1+/- presentan concentraciones circulantes de IGF-1 significativamente bajas, así como evidencia de peroxidación lipídica en hígado, con hiperexpresión de genes relacionados a proteínas del complemento y proinflamatorias e hipoexpresión de enzimas antioxidantes y factores inhibidores de la apoptosis. Además, exhiben alteraciones significativas en proteínas del citoesqueleto, uniones estrechas, y reducción en la expresión de genes que codifican para proteínas esenciales de la matriz extracelular hepática que parecen provocar una incorrecta organización de la arquitectura hepática. Asimismo, se aprecia hiperexpresión del gen del receptor de IGF-1 en hígado, contrario a lo observado en el hígado sano. Discusión: Los resultados presentados en este trabajo demuestran que la mera deficiencia parcial de IGF-1 se asocia con claras alteraciones en la arquitectura hepática, que se acompañan de una expresión alterada de genes que codifican para proteínas del citoesqueleto, implicadas en la polaridad de los hepatocitos y en las uniones intercelulares, así como en las principales proteínas de la matriz extracelular (Colágenas tipo I y V), proteoglicanos, fibronectina, integrina-b2 y el CTGF (IGFBP-8), así como una hiperexpresión de genes que codifican para proteínas de fase aguda, del complemento y proapoptóticas. Además, los animales deficientes hiperexpresaban el gen del receptor de IGF-1 en hígado, que no se expresa en condiciones normales, sugiriendo que la sola deficiencia de IGF-1 convierte al hígado en un órgano más vulnerable al daño oxidativo. El tratamiento sustitutivo con IGF-1 a dosis bajas corrige la mayor parte de estos hallazgos.