Simplificación del proceso de extracción de ácidos nucleicos en muestras fecales para diagnóstico por pcr en tiempo real

Resumen

Las técnicas moleculares han revolucionado el diagnóstico microbiológico y representan una clara alternativa a los métodos convencionales por su rapidez, sensibilidad y especificidad. Dentro de las técnicas moleculares, la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (qPCR) se ha convertido en un método de diagnóstico muy utilizado en los últimos años. Para poder llevar a cabo los ensayos mediante qPCR es necesaria una etapa previa de extracción de muestras biológicas, con la que se obtienen los ácidos nucleicos necesarios para realizar el ensayo. El método de extracción o purificación suele ser largo, complejo, pudiendo llegar a ser una fuente de error, además de que algunos utilizan productos tóxicos o corrosivos. Por ello, el desarrollo de un método rápido y simple para el tratamiento de muestras biológicas es interesante para la mejora del diagnóstico. En la bibliografía están descritos algunos métodos rápidos de tratamiento de muestras, sobre todo, para sangre, plasma o cultivos. Debido a la heterogeneidad de las muestras fecales y la gran cantidad de sustancias inhibidoras que contienen, apenas hay métodos rápidos disponibles para este tipo de matriz biológica. Por ello, el objetivo que se persigue es desarrollar un método de tratamiento de muestras fecales que sea rápido, sencillo, universal, que conlleve el menor riesgo posible para el usuario y que sea compatible con la tecnología qPCR. La presente tesis contiene el desarrollo del método (reactivo y procedimiento) para el tratamiento de muestras fecales, además de dos estudios clínicos para evaluar su funcionalidad. También se lleva a cabo un estudio de posibles sustancias interferentes en la reacción de qPCR. Para desarrollar un método (reactivo y procedimiento) válido para el tratamiento de muestras fecales se ha trabajado en la reducción o neutralización de inhibidores procedentes de la muestra biológica, en la lisis del patógeno y en la estabilidad de los ácidos nucleicos durante y tras el proceso. Tras los ensayos realizados, el método de tratamiento de muestras fecales obtenido, VIASURE Lysis & NA Stabilization Buffer, cumple las siguientes características: - Es rápido, siendo el tiempo total para realizarlo de aproximadamente 20 minutos. Mucho menos que métodos de extracción de rutina (70-90 minutos). - Es sencillo, ya que son pocas etapas y fáciles de llevar a cabo. - Es universal, ya que obtiene muy buenos resultados en la detección de patógenos de diferente naturaleza, partiendo del mismo sobrenadante, y sin tener que realizar modificaciones específicas según patógeno. - Es seguro, como se concluye del análisis de riesgos químicos llevado a cabo. - Es reproducible. Además, el sobrenadante obtenido se puede utilizar en diferentes termocicladores con diversos kits de qPCR VIASURE Real Time PCR Detection Kit. - Es estable, tanto la mezcla necesaria para llevar a cabo el procedimiento, como la integridad de los ácidos nucleicos contenidos en los sobrenadantes obtenidos por el método. - No afecta a la reacción de amplificación. Tras realizar un estudio de inhibición se observa que la mezcla no influye en la qPCR. - Es específico y sensible. Según los resultados de las evaluaciones clínicas realizadas, muestra mejores características de funcionalidad con respecto a otros métodos rápidos disponibles en el mercado. Además, genera resultados muy similares a métodos de extracción, manuales y automáticos, que se utilizan de rutina en los laboratorios clínicos. Los resultados obtenidos hasta el momento indican que VIASURE Lysis & NA Stabilization Buffer puede llegar a ser una gran herramienta junto con la técnica de qPCR en la simplificación del diagnóstico molecular.