Caracterización y regulación de la chaperona de cobre para la cuzn superóxido dismutasa cloroplástica de soja

Resumen

La chaperona de cobre para la CuZn superóxido dismutasa (CCS) pertenece a una nueva clase de proteínas eucarióticas y solubles. Su función es liberar Cu+ a la CuZn superóxido dismutasa (CuZnSOD). La CuZnSOD cloroplástica (CSD2) es una enzima antioxidante capaz de eliminar los radicales superóxido generados durante el transporte electrónico fotosintético. En Arabidopsis se ha descrito que la localización de CCS es dual, citosólica y cloroplástica. Esto es debido a que dentro del marco de lectura de este gen existen dos ATGs que generan dos sitios de inicio de la transcripción. En plantas han sido identificadas las CCS de Arabidopsis, tomate, patata y maíz. La estructura de CCS consiste en tres dominios diferentes; un dominio central homólogo a la CuZnSOD flanqueado por los dominios uno y tres, los cuales contienen motivos conservados de unión a metal. Recientemente se ha demostrado la existencia de dos átomos de Cu y un átomo de Zn por proteína, así como un cluster de cobre responsable de la formación de dímeros o tetrámeros. En este trabajo se ha estudiado la regulación de la expresión de los genes GmCSD2 y GmCCS en suspensiones celulares fotosintéticas y planta entera de soja (Glycine max) tanto en condiciones control como en exceso de cobre (10µM CuSO4). El gen GmCCS está regulado por un mecanismo de splicing alternativo con retención de intrón que genera 4 transcritos (GmCCS, NSP-GmCCS1, NSP-GmCCS2 y NSP-GmCCS3) en suspensiones celulares y 3 transcritos (GmCCS, NSP-GmCCS2 y NSP-GmCCS3) en planta entera de soja. Estos transcritos se expresaron en todos los tejidos analizados: hoja joven, hoja madura, tallo, raíz y flor. La expresión del gen se induce fuertemente en respuesta al exceso de Cu en el medio. El gen GmCSD2 está regulado por un mecanismo de splicing alternativo con retención de intrón que genera 2 transcritos (GmCSD2 y NSP-GmCSD2), tanto en suspensiones celulares como en planta entera de soja. Estos transcritos se expresaron en todos los tejidos analizados: hoja joven, hoja madura, tallo, raíz y flor. La expresión del gen se induce fuertemente en respuesta al exceso de Cu en el medio. A nivel de proteína, la expresión de GmCCS se mantiene constante en respuesta al exceso de Cu. La chaperona se encuentra formando mayoritariamente estructura oligomérica en forma posiblemente de trímeros, aunque la forma monomérica y NSP-GmCCS3 también se detectan en suspensiones celulares y planta entera de soja. El trímero se localiza tanto en el estroma como en el tilacoide y es estable incluso hirviendo en condiciones desnaturalizantes, mientras que las otras dos formas se encuentran únicamente en el estroma. La expresión de la enzima GmCuZnSOD es indetectable en las suspensiones celulares y plantas de soja crecidas en condiciones control pero su expresión se induce fuertemente en respuesta al exceso de Cu. Se han detectado tres isoformas de la GmCuZnSOD cloroplástica que se localizan tanto en el estroma como en la membrana tilacoidal. Se ha purificado la proteína recombinante GmCCS de suspensiones celulares de soja con un alto grado de pureza. La preparación es una mezcla de la proteína con y sin el péptido señal, posiblemente digerido por las propias proteasas endógenas de la bacteria recombinante. La proteína GmCCS recombinante pura se obtiene como apo y es activa ya que se ha demostrado que une dos moles del ión Cu+ y un mol del ión Zn2+ por mol de proteína. La chaperona presenta un sitio con alta afinidad y otro con menor afinidad de unión a Cu+, además posee un sitio de unión a Zn2+ de menor afinidad que los del Cu+. No se observaron cambios significativos en su estructura secundaria por efecto del Cu, lo que indica que se purifica en forma plegada. Se ha buscado sin éxito la hipotética cpCCS que transporta Cu desde HMA6 (envuelta) hasta HMA8 (tilacoide) en soja.