Epidemiología y cinética de crecimiento y supervivencia de vibrio parahaemolyticus en moluscos bivalvos de interés comercial

Resumo

Vibrio parahaemolyticus es una especie bacteriana que puede ser un patógeno importante en humanos, causante principalmente de infecciones gastrointestinales tras el consumo de moluscos crudos o poco cocinados. La especie es heterogénea y comprende variantes no patogénicas, al carecer por ejemplo, de los genes de virulencia tdh y/o trh, y patogénicas, por poseer los mencionados genes. A diferencia de EE.UU., en Europa se han realizado pocos estudios epidemiológicos sobre este patógeno en moluscos, por ello, la información de la que se dispone es limitada. La presente Tesis Doctoral pretende cubrir parte de este vacío al obtener nuevos datos sobre esta bacteria en Europa, en concreto en la costa mediterránea española. Los resultados que se han obtenido, no sólo son novedosos sino que, además, tienen el valor añadido de que podrán ser utilizados en un modelo de análisis de riesgo y servir para el desarrollo de un nuevo marco normativo de regulación en seguridad alimentaria que controle la amenaza que representa este patógeno emergente en Salud Pública. A grandes rasgos, esta Tesis Doctoral se divide en dos partes y en cada una de ellas se plantearon una serie de objetivos específicos. En la primera parte se procedió a la detección, aislamiento y caracterización de V. parahaemolyticus a partir de bivalvos en la costa mediterránea, y al estudio de su prevalencia y de sus relaciones con otras cepas de origen europeo. Y en la segunda, se procedió al desarrollo de un modelo de experimentación in vivo para la exposición de almejas con cepas seleccionadas representativas de las variantes patogénica y no patogénica de V. parahaemolyticus, para estudiar el crecimiento y la supervivencia de esta especie en Ruditapes spp. tanto en el medio acuático (contaminación in vivo de almejas adultas por baño), como en la fase de post-cosecha, por almacenamiento de las almejas tras la exposición experimental a diferentes temperaturas. Para asegurarnos de que el modelo es repetible se tuvo que conseguir determinadas condiciones como que las almejas utilizadas en las contaminaciones estuvieran libres de vibrios no fermentadores de sacarosa (entre los cuales se encuentra V. parahaemolyticus) por lo que se abordó el estudio de la eficacia de un sistema experimental de depuración. Los moluscos bivalvos estudiados en el presente trabajo doctoral proceden de las dos bahías que componen el delta del Ebro, y que se caracterizan por ser importantes zonas de producción acuícola a nivel nacional. Para la detección y caracterización de V. parahaemolyticus se llevaron a cabo pruebas fenotípicas, que componen la microbiología clásica y diferentes técnicas moleculares que determinaron la presencia de los genes tlh, tdh y trh. El análisis de la variabilidad genética de las cepas identificadas se realizó usando las técnicas de valor epidemiológico rep-PCR y electroforesis en gel de campo pulsante (PFGE). Los datos recogidos se analizaron estadísticamente en función del diseño de los diferentes estudios y las características de las variables recogidas. Los resultados que se han obtenido en la primera parte de esta Tesis Doctoral ponen de manifiesto la presencia de V. parahaemolyticus potencialmente patógeno para humanos en cuatro especies de moluscos bivalvos cultivados en el delta del Ebro, y la detección por primera vez en Europa de la coexistencia de los genes tdh y trh en una misma cepa bacteriana. Al analizar estadísticamente los datos de prevalencia en función de diversas variables asociadas con el hospedador y con el medio ambiente, se encontraron diferencias significativas en relación a la especie de molusco, siendo las almejas del género Ruditapes las que presentaron un mayor riesgo de estar contaminadas por V. parahaemolyticus en comparación con el resto de las especies de bivalvos estudiadas. Además, se detectó una relación directamente proporcional entre la prevalencia de V. parahaemolyticus en bivalvos y la salinidad (incrementándose el riesgo 1,27 veces por cada unidad de ppt que aumentara la salinidad) y, lo que es más interesante, una relación inversamente proporcional entre prevalencia de la variante patogénica de V. parahaemolyticus (trh+) y la salinidad (disminuyendo el riesgo 1,64 veces por cada unidad de ppt que aumentara la salinidad). Finalmente, se observó una gran diversidad genética al comparar diferentes cepas europeas de V. parahaemolyticus. La segunda parte de esta Tesis se centró en diversos estudios experimentales en laboratorio bajo condiciones controladas de algunas variables. Fundamentalmente se estudió la supervivencia de V. parahaemolyticus en Ruditapes spp., tanto en el medio acuático por contaminación in vivo de R. decussatus y R. philippinarum por baño, como también en la fase de post-cosecha por almacenamiento de Ruditapes spp., tras la contaminación in vivo de estas almejas por baño, a diferentes temperaturas del aire. Para llevar a cabo estos estudios, se validó en primer lugar la eficacia de un protocolo experimental de depuración con el fin de lograr la eliminación hasta niveles casi indetectables de vibrios no fermentadores de sacarosa con el fin de realizar la incorporación bacteriana bajo condiciones ambientales controladas y con dosis inoculadas conocidas. Posteriormente se estableció el crecimiento y supervivencia de V. parahaemolyticus en diferentes especies de almejas en el modelo, llevando a cabo una contaminación in vivo por baño, encontrando que R. decussatus incorporó y eliminó ambas variantes de V. parahaemolyticus más rápidamente que las almejas de la especie R. philippinarum. Por otra parte, en las mismas condiciones se observó que la variante no patogénica podría sobrevivir mejor que la variante patogénica de V. parahaemolyticus en las dos especies de almejas estudiadas. La importancia y, por lo tanto, el impacto de estos resultados es doble, ya que no sólo amplían el conocimiento de esta bacteria, sino que se demuestra que es posible el uso de la variante no patogénica para estudios posteriores de modelización evitando los riesgos para los investigadores. Seguidamente, se llevó a cabo un estudio con las dos especies de almejas cohabitando en el mismo tanque para describir un posible efecto hospedador en la etapa de meseta del estudio anterior (de 20 a 70 h post-inoculación). Los resultados obtenidos en este experimento no fueron lo suficientemente significativos como para confirmar las diferencias en el patrón de incorporación de la variante no patogénica de V. parahaemolyticus en el periodo citado; sin embargo se observó una tendencia marginal diferencial que ponía de manifiesto que R. decussatus tenía concentraciones ligeramente superiores de la variante no patogénica de V. parahaemolyticus que R. philippinarum, lo que concuerda con los resultados obtenidos en el estudio anterior en el que las dos especies de almejas se contaminaron y mantuvieron por separado. A su vez, los resultados de este estudio ponen de manifiesto que la diferencia en los niveles bacterianos adquiridos por cada una de las especies de almejas podrían estar relacionados con la temperatura del tanque (16-18ºC), temperatura más próxima a la temperatura óptima de filtración de R. decussatus que de R. philippinarum. Finalmente se abordó el estudio del comportamiento de V. parahaemolyticus en almejas del género Ruditapes que habían sido almacenadas a diferentes temperaturas del aire, tras la exposición experimental por baño a esta bacteria. Las temperaturas elegidas para este estudio fueron las temperaturas típicas del invierno y del verano en el mediterráneo, simulando la situación de manejo comercial (en puerto pesquero, cubierta de barcos, etc.), y, asimismo, temperaturas de refrigeración, simulando el ambiente de restaurantes y hogares. Las densidades de V. parahaemolyticus totales y patógenos fueron determinadas en distintos momentos (0, 24, 48, 72 y 96 horas) de almacenamiento. Tanto la variante patogénica humana como la variante no patogénica de V. parahaemolyticus se multiplicaron rápidamente en almejas almacenadas a 28ºC, mostrando un incremento de al menos 3 log ufc/g a 72 h, en ambas variantes. La variante no patogénica de V. parahaemolyticus almacenada a 4ºC y a 15ºC mostró una disminución de 1 log ufc/g y de 2 log ufc/g a 96 h, respectivamente, mientras que no se detectaron diferencias significativas para la variante patogénica de V. parahaemolyticus almacenada a dichas temperaturas. Estos resultados sugieren que la variante patogénica de V. parahaemolyticus podría sobrevivir mejor que la variante no patogénica en almejas (R. philippinarum) almacenadas tras la cosecha a 4 y a 15ºC. En definitiva los estudios que forman parte de esta Tesis Doctoral proporcionan información relevante que podrá utilizarse para cumplimentar las lagunas que existen en las actuales evaluaciones del riesgo relativo a la presencia de V. parahaemolyticus en Europa. Estos datos podrán ser utilizados ¿si se estima adecuado¿ en futuros modelos de análisis de riesgo de esta bacteria, así como para la elaboración de políticas de gestión de riesgo encaminadas a reducir las enfermedades en humanos asociadas a este patógeno de origen alimentario.