Componentes y mecanismos del sistema NbIS en la cianobacteria Synechococcus elongatus PCC 7942

Resumen

Componentes y mecanismos de señalización del sistema NblS en la cianobacteria Synechococcus elongatus PCC 7942 Introducción Las cianobacterias constituyen un grupo de procariotas Gram negativos capaces de realizar fotosíntesis oxigénica. Este grupo de autótrofos, anteriormente conocido como algas verde-azules, posee un aparato fotosintético similar al de las plantas y es considerado como el ancestro de los cloroplastos vegetales. Desde su origen, registrado hace 2500 millones de años, este grupo ha tenido gran éxito evolutivo y posee un alto valor ecológico al participar en procesos fundamentales para el equilibrio de la biosfera como son la producción de oxígeno y la fijación de carbono y nitrógeno. Synechococcus elongatus PCC 7942 (en adelante S. elongatus) es una cianobacteria fotoautótrofa obligada, bacilar, de agua dulce, unicelular, no tóxica y no diazotrófica. Su genoma está completamente secuenciado y un mapa de alta resolución de su transcriptoma está disponible. S. elongatus es un organismo oligoploide, ya que posee de 3 a 4 copias cromosómicas por célula. Es una de las cianobacterias más usadas como organismo modelo, siendo de gran interés para el estudio de procesos comunes y característicos, o de particular relevancia, para este grupo: metabolismo de carbono y nitrógeno, aclimatación a una variedad de estreses nutricionales y ambientales, fotosíntesis oxigénica. S. elongatus es además el único sistema modelo utilizado para el estudio de los ritmos circadianos en procariotas. Para adaptarse a la diversidad de ambientes, las cianobacterias usan proteínas sensoras y reguladoras para modular su funcionamiento celular. Son los microorganismos que presentan un mayor número de sistemas de dos componentes en relación al tamaño de su genoma. En la transducción de la señal de un sistema de dos componentes típico, el sensor o histidina quinasa se activa en respuesta a un estímulo y se autofosforila en un residuo conservado de histidina. El grupo fosforilo es transferido posteriormente desde la histidina quinasa a un residuo de aspártico conservado en el regulador de la respuesta, lo cual modifica su actividad generando así una respuesta ante el estímulo percibido. En los sistemas de dos componentes típicos las parejas histidina quinasa y su regulador de respuesta suelen estar codificados en un mismo operón. Sin embargo, una característica de las cianobacterias es la alta proporción de componentes huérfanos. En S. elongatus, los reguladores de respuesta superan en número a las histidinas quinasas por casi 2:1. Por tanto, no se puede predecir a partir de la información genómica qué componentes participan en el mismo sistema de señalización. NblS (non-bleaching sensor) es la histidina quinasa más conservada en cianobacterias. Ejerce una regulación negativa sobre genes relacionados con la aclimatación al estrés, la cual es dependiente de secuencias específicas denominadas HLR1 (high ligth regulatory sequence). Las secuencias HLR1 fueron identificadas como un elemento requerido para reprimir ciertos genes fotosintéticos en condiciones de baja luz y se presentan como repeticiones directas imperfectas de ocho nucleótidos separadas por dos nucleótidos. Trabajos previos habían sugerido que los reguladores RpaB y RpaA estaban implicados en la transducción de señales de estrés de NblS. RpaA resultó formar parte de un sistema de dos componentes con la histidina kinasa SasA, implicada en la regulación del ritmo circadiano. Por otra parte, se relacionó a RpaB con las secuencias HLR1. La localización de dichas secuencias, relativa al sitio de iniciación de la transcripción, determina el tipo de regulación ejercida por RpaB. Se ha llegado a demostrar que la unión de RpaB a secuencias HLR1 en S. elongatus se pierde tras someter a los cultivos a estrés por alta luz. Este tipo de evidencias sugerían que NblS y RpaB serían componentes del mismo sistema, aunque la conexión funcional entre ambas no había sido demostrada. Justificación y objetivos Desconocíamos la composición de la ruta de señalización de NblS, es decir, con qué regulador de respuesta funcionaba. El grupo de investigación acababa de establecer que el principal candidato hasta entonces, el regulador de respuesta NblR no interaccionaba con NblS, y ni siquiera era fosforilable. Por tanto, las proteínas NblS y NblR constituían dos rutas diferentes de señalización de las que se sabía muy poco. En el primer caso, era importante identificar el o los reguladores de respuesta que interaccionaran con NblS. En esta Tesis conseguimos establecer que se trataba de un sistema de dos componentes ramificado, con dos rutas de fosforilación. Una ruta esencial, representada por la proteína RpaB, y otra no esencial representada por SrrA, y sobre la que no existía ningún tipo de información funcional previa. Hemos tratado de establecer una conexión funcional y específica entre NblS y los reguladores de respuesta RpaB y SrrA, demostrar la esencialidad de la ruta de fosforilación NblS-RpaB y profundizar en las peculiaridades e interacciones de este sistema de transducción de señales. Resultados y discusión Dos tipos de aproximaciones (in silico y análisis doble híbrido de levaduras) nos sugirieron que NblS, RpaB y SrrA formaban un sistema de dos componentes ramificado. En el transcurso de esta tesis ha quedado claro que la ruta NblS-RpaB es esencial. Ni las inserciones de marcadores de resistencias ni las mutaciones puntuales en residuos fosforilables son viables. También hemos excluido efectos polares complementando las mutaciones nulas rpaB en trans. En esta tesis hemos demostrado que la ruta de fosforilación esencial es hacia RpaB y que además RpaB, que es muy abundante, reprime normalmente a srrA, y que solamente en presencia de factores de estrés se induce la expresión de srrA. Dicho de otra forma, existe una separación ambiental que permite funcionar normalmente y a alto nivel a la ruta esencial NblS-RpaB a pesar de la preferencia de NblS por fosforilar a SrrA. La idea es que la proteína SrrA se acumula transitoriamente tras la inducción por estrés y a esta transitoriedad contribuiría SrrA, que según nuestros datos in vivo, también reprime genes con secuencias HLR1, y por tanto se autoregularía negativamente. Puesto que la imposibilidad de construir mutantes nulos dificultó los estudios funcionales de las rutas correspondientes, y con el objetivo de identificar funciones celulares dependientes de RpaB en condiciones normales de crecimiento, recurrimos a la obtención de mutaciones sutiles o poco drásticas. Para ello construimos derivados con mutaciones en rpaB que alteran (incrementan o disminuyen) su nivel de expresión. Posteriormente estudiamos el efecto de la sobreexpresión condicional de RpaB y el de proteínas de fusión (a GFP o YFP), que resultaron tener propiedades ligeramente diferentes a RpaB. A pesar de que los transcritos sí fluctuaron en situaciones de estrés, los niveles de proteína RpaB se mantuvieron constantes durante los cambios, lo que sugiere que existen mecanismos de regulación postranscriptional que evitarían fluctuaciones importantes de los niveles de RpaB en S. elongatus. Consistente con la importancia de mantener constantes los niveles de RpaB, diferencias relativamente pequeñas en éstos (obtenidas mediante aproximaciones genéticas) resultaron en diferencias fenotípicas significativas en cuanto a la longitud celular. Los niveles intracelulares de RpaB resultaron relativamente altos para un regulador transcripcional. Esto y la gran estabilidad relativa de RpaB~P en comparación con la forma fosforilada de otros reguladores de respuesta, permitieron el seguimiento de las formas fosforilada y desfosforilada en S. elongatus, lo que resultó muy informativo en el contexto del análisis fenotípico de las estirpes construidas en esta Tesis. Los resultados obtenidos chocan con un modelo simplista on/off para la actividad de RpaB. En conjunto, nuestros datos indican que tanto RpaB como RpaB~P son funcionales en S. elongatus. Nuestro trabajo es el primer estudio en el que se determinan los niveles in vivo de las dos formas de un regulador de respuesta y se relacionan con funciones concretas, de momento la longitud celular y la expresión del gen diana srrA.