Caracterización de un modelo biológico para el estudio del transporte nucleocitoplasmico. Expresión funcional de la proteína recombinante gfp nucleoplasmina en células de melanoma humano

Zusammenfassung

El presente trabajo de Tesis Doctoral tiene como finalidad profundizar en el conocimiento de los procesos que modulan el tráfico de proteínas entre el citoplasma y el núcleo. Para ello, estudiaremos el comportamiento de una de las proteínas cariofílicas más utlizadas en ensayos de transporte, la nucleoplasmina, estableciendo un modelo de transporte nucleocitoplásmico mediante su transfección in vivo en la línea celular de melanoma humano A375. La nucleoplasmina (Np) es la proteína descondensadora de la cromatina de los espermatozoides de Xenopus laevis, tras la fertilización del huevo de la rana, participando en importantes actividades biológicas como son la remodelación de los nucleosomas, la transcripción y la activación génica y la descondensación de cromatina. Para lograr este objetivo, se fusionó el cDNA de la Np, al extremo terminal de la proteína fluorescente GFP, creando el plásmido pGFP-Np, que fue transfectado de manera estable en dicha línea celular. Por otro lado, se transfectó establemente un plásmido para la expresión de la GFP en la misma línea celular. Como resultado se obtuvieron las líneas celulares A375 GFP, y A375 GFP-Np, que sirvieron de base para la tesis. La GFP-Np expresada de manera constitutiva in vivo resulta ser una proteína cariofílica, es decir de localización nuclear, aunque excluida de los nucleolos. Además, tras la fusión de la GFP, se mantiene la estructura pentamérica original de la Np, mantenida por las interacciones Np-Np y la proteína GFP-Np es capaz de interaccionar de manera correcta con todas las proteínas que lo hace la Np. Finalmente se comprueba que la GFP-Np es capaz de descondensar cromatina, al igual que la Np, debido a la fosforilación que sufre in vivo. En definitiva, el melanoma humano es capaz de interaccionar con la GFP-Np, modificarla y regular su función de igual manera que ocurre con la Np en los huevos y ovocitos de Xenopus. Asimismo, la