Filogenia de la familia halomonadaceae basada en el análisis por secuenciación multilócica (mlsa)

Resumo

La familia Halomonadaceae constituye una rama filogenética independiente dentro de la clase Gammaproteobacteria en base al análisis de la secuencia del gen ARNr 16S y principalmente está formada por bacterias halófilas. Desde su creación en 1988 (Franzmann y col., 1988), la posición taxonómica de esta familia ha sido modificada en múltiples ocasiones. Actualmente, la familia Halomonadaceae comprende 10 nombres de géneros válidamente publicados, siendo Halomonas (Vreeland y col., 1980; Dobson y Franzmann, 1996), con 62 especies, y Chromohalobacter (Ventosa y col., 1989; Arahal y col., 2001), con nueve especies, los más destacados. Los siguientes géneros contienen una única especie hasta el momento: Zymobacter (Okamoto y col., 1993), Carnimonas (Garriga y col., 1998; Arahal y col., 2002b), Cobetia (Arahal y col., 2002a), Halotalea (Ntougias y col., 2007), Modicisalibacter (Ben Ali Gam y col., 2007), Salinicola (Anan'ina y col., 2007; 2008) y Aidingimonas (Wang y col., 2009). Finalmente, el género Kushneria (Sánchez-Porro y col., 2009) agrupa cuatro especies. Esta familia está compuesta por bacterias Gram-negativas, quimioorganotrófas, la mayoría de las cuales son capaces de crecer entre el 5 y el 10% de NaCl, 25-35 º C y pH 7,0-8,0. A excepción de estas características que son comunes para la mayoría de los miembros de la familia Halomonadaceae, este grupo es muy heterogéneo, no sólo desde el punto de vista fenotípico, sino también genotípico. Así pues, incluye bacilos y cocos, microorganismos aerobios y anaerobios facultativos, halófilos débiles, halófilos moderados, haloalcalófilos, halotolerantes y no halófilos con un contenido en G + C del ADN que varía desde 52,0 a 74,3 moles%. Además, los miembros de la familia Halomonadaceae se han aislado de una gran variedad de hábitats, como aguas salinas e hipersalinas, suelos salinos, salinas solares, alimentos, plantas, animales, yacimientos petrolíferos, etc. Además, recientemente algunas cepas han sido reconocidas como patógenos humanos causantes de infecciones y contaminaciones en un centro de diálisis renal (Stevens y col., 2009). En el año 2002, Arahal y col. (2002b) llevaron a cabo un estudio filogenético de las especies de la familia Halomonadaceae cuyos nombres había sido válidamente publicados hasta la fecha (un total de 25) mediante el análisis comparativo de secuencias de los genes ARNr 23S y 16S. Éste es el único estudio filogenético detallado que se ha realizado en esta familia y, desde entonces, 57 especies nuevas se han publicado y, en algunos casos, sus relaciones filogenéticas aún no han sido claramente determinadas. Asimismo, algunas de las secuencias disponibles del gen ARNr 16S en las bases de datos EMBL/GenBank/DDBJ no alcanzan los estándares mínimos recomendados para Halomonadaceae (Arahal y col., 2007). Además de las características fenotípicas, la taxonomía de procariotas actual está basada principalmente en el análisis de la secuencia del gen ARNr 16S. Recientemente, otros marcadores filogenéticos alternativos al ARNr 16S, llamados genes housekeeping, se han estudiado con el objetivo de llevar a cabo un análisis por secuenciación multilócica (Multilocus Sequence Analysis, MLSA), el cual puede proporcionar datos adicionales que apoyen las presentes clasificaciones de procariotas. Hasta el momento, los genes housekeeping utilizados para estudio de la familia Halomonadaceae han sido ARNr 23S (Arahal y col., 2002b; Lee y col., 2005), gyrB y etcBC, aunque estos dos últimos únicamente han sido estudiados en el caso de la especie Halomonas variabilis (Okamoto y col., 2004). El propósito de esta Tesis Doctoral ha sido estudiar en detalle las relaciones filogenéticas de las especies de la familia Halomonadaceae y clarificar la clasificación actual de esta heterogénea familia mediante una aproximación por MLSA basado en la secuencia de los genes ARNr 16S, ARNr 23S, atpA, gyrB, rpoD y secA. Además, siguiendo las recomendaciones de los estándares mínimos definidos para la familia Halomonadaceae, se han secuenciado nuevamente siete secuencias del ARNr 16S de cepas tipo con el objetivo de resolver las posiciones indeterminadas y alcanzar los estándares de calidad (Arahal y col., 2007). En base a este estudio, también se ha llevado a cabo una completa investigación polifásica que nos ha permitido proponer la descripción de nuevos taxones. El análisis por secuenciación multilócica ha revelado que la familia Halomonadaceae forma un grupo monofilético dentro del orden Oceanospirillales. Todos los géneros incluidos en esta familia son coherentes desde el punto de vista filogenético, a excepción de Modicisalibacter, cuya posición taxonómica como género independiente no está clara, y Halomonas, que es polifilético. El género Halomonas comprende dos clúster claramente diferenciados: el grupo 1 incluye la especie Halomonas elongata (especie tipo del género) y las especies H. eurihalina, H. caseinilytica, H. halmophila, H. sabkhae, H. almeriensis, H. halophila, H. salina, H. organivorans, H. koreensis, H. maura y H. nitroreducens. El grupo 2 comprende las especies Halomonas aquamarina, H. meridiana, H. axialensis, H. magadiensis, H. hydrothermalis, H. alkaliphila, H. venusta, H. boliviensis, H. neptunia, H. variabilis, H. sulfidaeris, H. subterranea, H. janggokensis, H. gomseomensis, H. arcis y H. subglaciescola. Más de 20 especies de Halomonas no pueden incluirse filogenéticamente ni en el grupo 1 (denominado Halomonas sensu stricto) ni en el grupo 2 y, puesto que su posición en los diferentes árboles filogenéticos no es estable, tampoco pueden reconocerse como un grupo adicional. Las especies Halomonas halodurans y Cobetia marina se agrupan juntas en todos los árboles inferidos y los valores de hibridación ADN-ADN obtenidos entre las cepas tipo de las dos especies son iguales o superiores al 97 %. Por tanto, un estudio más extenso comparando ambas especies es requerido para determinar su correcta delimitación taxonómica. Los árboles filogenéticos basados en la secuencia de los genes ARNr 16S, ARNr 23S, gyrB y rpoD muestran que la cepa A10T, aislada de la superficie de las hojas del manglar negro Avicennia germinans, forma una rama filogenética coherente con las especies Halomonas marisflavi, H. indalinina y H. avicenniae. La filogenia basada en el gen secA muestra que la cepa A10T se agrupa junto con las especies H. campisalis y H. pacifica, debido probablemente a eventos de recombinación entre estas especies. No fue posible amplificar el gen atpA para la cepa A10T. Los estudios fenotípicos, genotípicos, quimiotaxonómicos y filogenéticos llevados a cabo en este grupo demostraron que la cepa A10T representa una nueva especie y género dentro de la familia Halomonadaceae, para la cual se ha propuesto el nombre de Kushneria aurantia gen. nov., sp. nov. Además, nuestros datos apoyan la reclasificación de las especies H. marisflavi, H. indalinina y H. avicenniae a este nuevo género, como Kushneria marisflavi comb. nov., Kushneria indalinina comb. nov. y Kushneria avicenniae comb. nov., respectivamente. Por otro lado, las especies Salinicola socius, Halomonas salaria y Chromohalobacter salarius constituyen una rama filogenética estable y coherente. Los análisis fenotípicos, genotípicos, quimiotaxonómicos y filogenéticos basados en la comparación de los genes housekeeping son consistentes e indican que estas tres especies constituyen un clúster separado de los otros miembros de Halomonadaceae, apoyando su ubicación en un mismo género. De esta manera, hemos modificado la descripción del género Salinicola y la de las especies Salinicola socius y hemos propuesto la transferencia de las especies Halomonas salaria y Chromohalobacter salarius al género Salinicola, como Salinicola salarius comb. nov. y Salinicola halophilus nom. nov., respectivamente. Además, en esta investigación hemos evaluado la capacidad de resolución de los genes housekeeping estudiados. La secuencia del gen secA es la que presentó una mayor tasa de evolución, seguida por la de los genes rpoD, gyrB, atpA, ARNr 23S y ARNr 16S. Sin embargo, los genes secA, gyrB, ARNr 23S y ARNr 16S no permitieron diferenciar varias parejas de taxones: Halomonas aquamarina y H. axialensis (gen secA); H. halocynthiae y H. koreensis (gen secA); H. aquamarina y H. meridiana (gen gyrB); Chromohalobacter beijerinckii y C. candensis (gen gyrB); H. halophila y H. salina (genes secA, gyrB, ARNr 23S y ARNr 16S); y Cobetia marina y Halomonas halodurans (genes ARNr 23S y ARNr 16S). Cinco de los seis genes estudiados (ARNr 16S, ARNr 23S, gyrB, rpoD y secA) mostraron una historia evolutiva similar y, por tanto, las filogenias inferidas a partir de ellos fueron bastante semejante. Los diferentes géneros y grupos intragenéricos definidos para la familia Halomonadaceae se conservan al utilizar estos cinco genes, aunque las posiciones relativas entre los grupos e incluso las relaciones dentro de un mismo grupo pueden variar dependiendo del gen estudiado. En base a estos resultados concluimos que la transferencia génica horizontal (HGT) juega un papel importante en la evolución de los miembros de la familia Halomonadaceae. Por otro lado, el gen atpA mostró una historia evolutiva diferente con respecto a los otros genes estudiados, de manera que no es útil como marcador filogenético en esta familia. El análisis de la secuencia concatenada de los seis genes minimizó el impacto de posibles eventos de recombinación al calcular relaciones filogenéticas con fines taxonómicos y dio como resultado una filogenia acorde a la actual situación taxonómica de la familia Halomonadaceae. Con independencia del gen (o genes) analizados, la filogenia de esta familia se ve afectada por el método utilizado para la construcción de los árboles. En general, los algoritmos maximum-likelihood y neighbour-joining dieron resultados más acordes entre sí que con respecto al algoritmo maximum-parsimony. Finalmente, aunque serían necesarios otros estudios mediante MLSA en los que se incluyeran varias cepas de la misma especie, en base a nuestros resultados utilizando los seis genes housekeeping estudiados, proponemos el uso de los genes ARNr 16S, gyrB y rpoD como los más adecuados para realizar estudios por MLSA en la familia Halomonadaceae.