Associació entre els nivells de tamoxifé i metabolits en sang i les característiques farmacogenètiques del pacient

Zusammenfassung

TITULO: Asociación entre los niveles de tamoxifeno y sus metabolitos en sangre y las características farmacogenéticas del paciente. INTRODUCCIÓN A/ Farmacogenética y farmacogenómica Friedrich Vogel definió el término Farmacogenética por primera vez en 1959 como el estudio de los factores genéticos que explicarían la variabilidad de la respuesta farmacológica.Vessel y Page en 1968 describieron la predisposición heredable a la respuesta farmacológica, al demostrar que en gemelos idénticos los niveles plasmáticos de algunos fármacos eran menos divergentes que entre mellizos. No todos los pacientes responden del mismo modo a los tratamientos: un porcentaje importante no responde (30-60%), y algunos sufren efectos secundarios severos (4-7%). Se estima que la variabilidad en la respuesta/toxicidad es genética en un 20-95% de los casos, y se debe a variaciones en la secuencia de genes que codifican para enzimas metabolizadoras, transportadoras ó dianas de fármacos. Farmacogenética y farmacogenómica pretenden descubrir las bases moleculares-genéticas de la variabilidad en los tratamientos, aumentando su respuesta y disminuyendo su toxicidad: medicina personalizada. Gracias a la consecución del Proyecto Genoma Humano en el año 2003 se ha producido la evolución de la Farmacogenética a la Farmacogenómica: se ha pasado del estudio de unos pocos marcadores genéticos a la práctica totalidad del Genoma Humano mediante los llamados GWAS (genome wide association studies). GWAS son estudios que comparan diferencias genéticas del genoma asociadas a distintos fenotipos de respuesta y/o toxicidad siguiendo el modelo caso-control. La farmacogenómica facilita la identificación de nuevos biomarcadores genéticos que pueden ayudar a optimizar la selección del fármaco, la dosis, y la duración del tratamiento y evitar reacciones adversas graves. La farmacogenómica puede promover nuevos hallazgos en el mecanismo de acción de los fármacos y como resultado puede contribuir al desarrollo de nuevos agentes terapéuticos. La FG analiza la variabilidad genética que influye en mecanismos farmacocinéticos (absorción, metabolismo, distribución y eliminación del fármaco) y farmacodinámicos (interacción con la diana). Los genes importantes en FG pueden clasificarse en tres grupos funcionales distintos: genes relacionados con el transporte y metabolismo de los fármacos, genes de las dianas terapeúticas, todos los demás genes con efectos indirectos en el proceso. La monitorización de los niveles de fármacos en sangre (plasma o suero) y orina se complementa con el análisis farmacogenético del paciente. La prueba para establecer la validez del análisis farmacogenético habitualmente se basa en la monitorización de los niveles del fármaco y sus metabolitos, para poder definir la correlación genotipo-fenotipo. La FG del metabolismo de fármacos es la principal responsable de las variaciones en los niveles de fármacos y sus metabolitos en sangre y en orina. La FG del metabolismo de fármacos estudia los genes que promueven su conversión de liposolubles a hidrosolubles, a través de reacciones fase I (hidrólisis, oxido-reducción, deshalogenación, descarboxilación, ¿) y reacciones de conjugación fase II (acetilación, metilación, esterificación, glucuronidación, sulfatación, ¿). Los polimorfismos de las enzimas de las fases I y II son un factor muy influyente en la concentración plasmática de los fármacos y su farmacocinética. Los miembros de la superfamilia génica del Citocromo P450 (unos 120 genes) han sido los principales objetivos de estudio FG pues catabolizan alrededor de un 80% de todos los fármacos y además sus polimorfismos se asocian a un 20-25% de la eficacia farmacológica global. Las enzimas de la familia del CYP450 son designadas mediante un número de familia, una letra de subfamilia, un número para una enzima individual dentro de la subfamilia, y un asterisco seguido de un número y una letra para cada variante genética (alélica). Los enzimas de la familia CYP450 son responsables mayoritarios de la fase I metabólica. Sólo contribuyen al metabolismo de fármacos las familias CYP1, CYP2 y CYP3. Las enzimas más polimórficas de esta familia y por tanto más importantes en FG son CYP2D6, CYP2C9 y CYP2C19. El hígado es el principal órgano donde se desarrolla el metabolismo de estas enzimas. La frecuencia de las distintas variantes alélicas varía entre poblaciones de acuerdo con su raza y etnia. Es importante saber que existen tanto inhibidores como inductores de la actividad de estas enzimas, y suelen ser sobre todo otros fármacos. CYP2D6 representa una de las enzimas mejor estudiadas por su gran variedad de alelos (más de 100) con repercusión en el metabolismo de los fármacos. Además, es la responsable del metabolismo de más de 70 fármacos. Los distintos genotipos de la gran variedad alélica de CYP2D6 se asocian con los siguientes fenotipos metabolizadores: - PM: pobre metabolizador, sin alelos funcionales en el genoma. - IM: metabolizador intermedio, con un alelo nulo y otro de actividad reducida. - EM: metabolizador eficiente ó extensivo, con uno o dos alelos funcionales. - UM: metabolizador ultrarápido, con múltiples alelos funcionales o variantes del promotor que potencian la expresión génica. Existen fármacos que son potentes inhibidores de CYP2D6 (fluoxetina, paroxetina, ¿) capaces de convertir un metabolizador extensivo en un metabolizador pobre, fenómeno denominado fenocopiado. La Oncología es el campo principal donde más se han desarrollado las aplicaciones FG. La evolución en el diseño de nuevos fármacos para nuevas dianas moleculares estos últimos años ha sido exponencial. La eficacia de estos nuevos tratamientos en algunos casos ha sido espectacular, llegando a curar definitivamente el tumor. La complicación radica en la existencia de dos genomas a analizar: el del paciente (línea germinal) y el del tumor (somático). La utilidad clínica está garantizada cuando administramos fármacos a dianas moleculares para las que han sido diseñados, que previamente hemos analizado y encontrado en el tumor (terapia dirigida). Estos biomarcadores FG somáticos tienen un efecto farmacodinámico, y su objetivo es la inhibición de proteínas mutadas claves para el origen y mantenimiento del tumor (tumor drivers). Su inhibición provoca el cortocircuito de vías de transducción de señales que desembocan habitualmente en la división celular descontrolada. Los biomarcadores FG en línea germinal del paciente son polimorfismos en enzimas de fases I y II, que provocan cambios en el metabolismo del fármaco, variando su respuesta y/o toxicidad. La mayor parte de la información FG se considera experimental o simplemente exploratoria, y sólo una pequeña parte de biomarcadores FG son considerados de utilidad clínica. Normalmente todos los biomarcadores FG que reúnen el nivel de evidencia exigido son recomendados por la FDA y otras agencias oficiales, y sólo algunos son de análisis obligatorio previo a la decisión terapeútica, sobre todo antitumorales y antivirales. Como todo test genético, el test FG para ser aprobado debe cumplir los siguientes requisitos: - Validez analítica: seguridad del test (máxima sensibilidad y especificidad) en identificar todas las variaciones genéticas asociadas a respuesta/toxicidad del tratamiento. - Validez clínica: valor predictivo del test (positivo y negativo) para el fenotipo de respuesta (niveles del fármaco, ¿) y/o toxicidad. - Utilidad clínica: el resultado debe ayudar a personalizar el tratamiento (cambio de fármaco, dosis, continuidad, evitar efectos adversos, ¿) mejorando la supervivencia y calidad de vida del paciente. B/ Principios de la Cromatografía Líquida Micelar (MLC) 1. FASE MÓVIL: disolución acuosa de tensioactivo > cmc (concentración micelar crítica) que forma agregados denominados micelas, posibilitando la implementación de nuevas formas de interacción. El tensioactivo más utilizado es el SDS: - Pureza elevada. - Bajo precio. - Fácil desorción de las columnas cromatográficas. - Bajo punto de Krafft (temperatura crítica micelar, 12º C). - Capacidad de eluir cualquier compuesto añadiendo disolvente. - Los datos de retención son reproducibles. - Solubiliza las proteinas en matrices biológicas. 2. FASE ESTACIONARIA: la más utilizada es la C18, cuyo relleno está unido covalentemente a la sílice. EFECTO DE LA COMPOSICION DE LA FASE MÓVIL EN LA RETENCIÓN: - Concentración de SDS: ¿ Si el soluto interacciona con las micelas ¿ comportamiento enlazante. ¿ Aumentando la concentración de tensioactivo ¿ disminuye la retención. - Efecto de los disolventes orgánicos en la MLC: ¿ Agua/micelas: - Fuerza débil del eluyente ¿ tiempos de retención largos. - Bajas eficacias ¿ picos cromatográficos amplios. ¿ Agua/disolvente orgánico/micelas: - Fuerza del eluyente adecuada. - Mejora la forma de los picos. ¿ Fase móvil óptima: máxima resolución y mínimo tiempo de análisis. ESTRATEGIAS DE OPTIMIZACION DE LA FASE MÓVIL 1. ESTRATEGIA DE OPTIMIZACIÓN SECUENCIAL - Cada variable se estudia de manera aislada mientras que el resto de parámetros permanecen fijos. - Cada conjunto de experimentos se diseña teniendo en cuenta los resultados obtenidos anteriormente. 2. ESTRATEGIA DE OPTIMIZACIÓN INTERPRETATIVA - Los experimentos se diseñan antes de desarrollar el proceso de optimización. - Se fija el valor de las variables experimentales y se hace un número determinado de ensayos. En cada uno se estudia una combinación de valores diferente. - Toda la información que se extrae del diseño experimental se utiliza para ajustar ecuaciones. - Predicción de la retención de los solutos y de las condiciones óptimas de separación. VENTAJAS MLC ¿ Versatilidad: se puede aplicar a matrices complejas: fluídos biológicos, productos farmaceúticos, etc ¿ ¿ Análisis de solutos con diferentes polaridades e hidrofobicidades. ¿ Baja cantidad de disolventes orgánicos. ¿ Procedimiento económico y ecológico. ¿ Inyección directa de los fluídos bíológicos. VALIDACIÓN DE LA METODOLOGÍA ANALÍTICA La validación consiste en una secuencia de ensayos que permiten demostrar la fiabilidad de un método analítico. Se aplica con un protocolo definido para la determinación de un analito específico y en un rango de concentraciones para un determinado tipo de ensayo y matriz. Se basa en los resultados estadísticos de los parámetros del proceso. Los resultados obtenidos con un método analítico validado son fiables, repetibles y constituyen una base sólida para la correcta toma de decisiones. Principales parámetros de validación ¿ Selectividad ¿ Linealidad y rango de concentraciones ¿ Límite de cuantificación (LOQ) ¿ Límite de detección (LOD) ¿ Precisión ¿ Exactitud ¿ Recuperación ¿ Robustez PACIENTES Y METODOS 1. Desarrollo y puesta a punto de la determinación del tamoxifeno y sus metabolitos en sangre de las pacientes mediante Cromatografía Líquida Micelar (MLC). Análisis de niveles del tamoxifeno y metabolitos a los 4 meses después del inicio del tratamiento. Para ello se empleó el cromatógrafo de Agilent Technologies Series 1100 (Palo Alto, CA, USA) equipado con una bomba cuaternaria, un desgasificador para la fase móvil, y un controlador de la temperatura acoplado al detector de fluorescencia. 2. Análisis de los polimorfismos en el gen CYP2D6 en línea germinal de las pacientes (sangre periférica), y asociación del genotipo con el fenotipo metabolizador. Para ello se empleó el equipo AmpliChip CYP450 (Roche Diagnostics), siguiendo las instrucciones del fabricante: se aisló el ADN de la sangre, se amplificó el gen CYP2D6, se cortó con DNAsa I y se marcó con biotina. A continuación se procedió a la hibridación del microarray y a la posterior lectura del perfil específico de hibridación (genotipo de CYP2D6). Posteriormente el software asigna su correspondiente fenotipo metabolizador. 3. Análisis de tamoxifeno y metabolitos tras escalada de la dosis a 40 mg/día y a 60 mg/día en el grupo de pacientes metabolizadores pobres (PM). RESUMENES DE ARTICULOS Estudios para monitorizar el tamoxifeno en pacientes con cáncer de mama mediante Cromatografía Líquida Micelar (MLC) Se describe un procedimiento de cromatografía líquida micelar sencillo para determinar el tamoxifeno en el plasma. Para realizar el análisis se realizaron diluciones de tamoxifeno en agua y fueron irradiadas con luz UV durante 20 min para formar el derivado fotociclado con un núcleo de fenantreno que muestra una fluorescencia muy intensa. Las muestras fueron luego inyectados directamente, evitando por tanto largos procedimientos de extracción y experimentales. La resolución de la matriz se realizó con una fase móvil que contiene 0,15 M de SDS, 7 % de n- butanol a pH 3, y flujo a 1,5 ml/min a través de una columna C18 a 40º C. La detección se llevó a cabo mediante fluorescencia, y las longitudes de onda de excitación y emisión fueron 260 y 380 nm, respectivamente. El tiempo de análisis fue inferior a 15 min. La metodología analítica fue validada siguiendo las directrices de las guías internacionales ICH. La respuesta del fármaco en el plasma fue lineal en el rango de 0,5-15 ¿g/ml, con coeficiente de regresión r2 > 0.999. Los parámetros de precisión y exactitud fueron < 9%. Los límites de detección (LOD) y de cuantificación (LOQ) fueron de 50 ng/ml y 150 ng/ml en plasma, respectivamente. El método desarrollado aquí no presenta interferencias con compuestos endógenos del plasma. Finalmente, el método analítico fue utilizado con muestras reales, midiendo las concentraciones de tamoxifeno en plasma de pacientes de un hospital local. Desarrollo de una metodología para cuantificar tamoxifeno y endoxifeno en pacientes con cáncer de mama mediante MLC y validación de acuerdo con las guías ICH Se describe un procedimiento sencillo de MLC (cromatografía líquida micelar) para determinar tamoxifeno y endoxifeno en plasma. Para el análisis, las soluciones de tamoxifeno y endoxifeno fueron diluidas en agua e irradiadas con luz UV durante 20 min para formar el derivado fotociclado con núcleo de fenantreno que muestra una intensa fluorescencia. Las muestras fueron inyectadas directamente, por tanto evitando largos y tediosos procedimientos de extracción y experimentales. La resolución de la matriz se realizó con una fase móvil que contiene 0,15 M de SDS, 7 % de n- butanol a pH 3, y flujo a 1,5 ml/min a través de una columna C18 a 40º C. La detección se llevó a cabo mediante fluorescencia, y las longitudes de onda de excitación y emisión fueron 260 y 380 nm, respectivamente. El tiempo de análisis fue de 20 min. La metodología analítica fue validada siguiendo las directrices de las guías internacionales ICH. La respuesta del fármaco en el plasma fue lineal en el rango de 0,5-15 ¿g/ml, con coeficiente de regresión r2 > 0.99. Los parámetros de precisión y exactitud fueron < 14%. Los límites de detección (LOD) y de cuantificación (LOQ) para endoxifeno fueron de 75 ng/ml y 250 ng/ml en plasma, y para tamoxifeno de 50 ng/ml y de 150 ng/ml, respectivamente. El método desarrollado aquí no presenta interferencias con compuestos endógenos del plasma. Finalmente, el método analítico fue utilizado con muestras reales, midiendo las concentraciones de tamoxifeno en plasma de pacientes de un hospital local. Determinación del tamoxifeno y sus principales metabolitos en muestras de plasma de pacientes con cáncer de mama mediante MLC Hemos desarrollado un método para el análisis del tamoxifeno y sus principales derivados (4-hydroxitamoxifeno, N-desmetil-tamoxifeno, tamoxifeno-N-oxido y endoxifeno) en plasma humano, empleando MLC acoplado a detección por fluorescencia. Los analitos fueron derivatizados off-line mediante irradiación con luz UV durante 20 min para formar los respectivos derivados fluorescentes fotociclados. A continuación las muestras fueron diluidas, filtradas y directamente inyectadas, evitando los largos procedimientos experimentales y de extracción. Los analitos fueron resueltos utilizando una fase móvil que contenía 0.08 M SDS, 4.5% n-butanol a pH 3, y un flujo de 1.5 ml/min a través de una columna C18 a 40º C, sin interferencias procedentes de otros compuestos endógenos del plasma. La detección se llevó a cabo mediante fluorescencia, y las longitudes de onda de excitación y emisión fueron 260 y 380 nm, respectivamente. El tiempo de análisis fue menor de 40 min. La metodología analítica fue validada siguiendo las directrices de las guías internacionales ICH, en términos de selectividad, el rango de linealidad fue 0,3-15 ¿g/ml, con coeficiente de regresión r2 > 0.999. Los parámetros de exactitud y de precisión fueron < 12.2% y < 9.2%, respectivamente. Los límites de detección (LOD) fueron entre 55 y 80 ng/ml, y de cuantificación (LOQ) fueron entre 165 y 220 ng/ml, para el tamoxifeno y sus metabolitos. Finalmente, el método analítico fue utilizado con muestras reales, midiendo las concentraciones de tamoxifeno y sus metabolitos en plasma de pacientes de un hospital local. Aumento de dosis de tamoxifeno incrementa la concentración plasmática de endoxifeno en pacientes con cáncer de mama temprano y fentipo PM Antecedentes: La enzima clave para el metabolismo del tamoxifeno es CYP2D6, transformándolo en su principal metabolito activo el endoxifeno. Pacientes PM para CYP2D6 tienen concentraciones muy bajas de endoxifeno en plasma con disminución en la eficacia del tratamiento. El aumento de dosis podría aumentar los niveles de endoxifeno hasta una concentración comparable a los pacientes con metabolismo eficiente (EM). Pacientes y métodos: Se realizó el genotipado de CYP2D6 y se midieron los niveles del tamoxifeno y sus metabolitos en plasma, de 249 pacientes con cáncer de mama en tratamiento adyuvante. En las pacientes con fenotipo PM se aumentó la dosis de tamoxifeno a 40 mg y 60 mg diarios durante un periodo de 4 meses. Se analizaron y compararon niveles de endoxifeno en cada una de las dosis, y con respecto a los niveles de pacientes con fenotipo EM. Resultados: Se identificaron 11 pacientes PM (4.7%). Los niveles de endoxifeno fueron significativamente más bajos que los de las pacientes EM (2.33 ng/ml, 11.30 ng/ml; p<0.001). Además, los niveles de endoxifeno aumentaron significativamente cuando subimos las dosis a 40 mg y 60 mg (8.38 ng/ml, 9.30 ng/ml; p=0.13, p=0.64, respectivamente). Conclusión: En pacientes PM el aumento de dosis del tamoxifeno al doble o al triple de la situación normal sube la concentración de endoxifeno a niveles similares a los de los pacientes EM, lo que debería suponer una mejoría en la respuesta. CONCLUSIONES - En esta tesis, se muestra como la MLC es una técnica útil en el análisis del tamoxifeno y sus metabolitos en muestras de suero o plasma de pacientes con cáncer de mama. - Una de las ventajas, y puede ser la más importante, es que el análisis es posible tan sólo con la dilución de la muestra y la inyección directa, abortando así el hacer uso de etapas tales como extracciones, preconcentraciones y/o derivatizaciones, todas ellas costosas en tiempo y dinero, además del beneficio ecológico que supone. - Para la determinación del tamoxifeno, la fase móvil fue 0.15 M SDS-7% n-butanol a pH 3, y el tiempo de análisis fue inferior a 15 min. - Los estudios de validación en este caso se llevaron a cabo haciendo uso de la guía Internacional ICH, que dió muy buenos resultados en términos de linealidad, selectividad, precisión y exactitud. Los LODs y LOQs son adecuados para estos tipos de estudios y los resultados comparables con otros obtenidos haciendo uso de técnicas más complejas como la detección por masas (LC-MS). - Estos estudios fueron repetidos con el uso de derivatización, ya que después de irradiar las muestras a 260 nm aumentaba la sensibilidad del método. - Podemos afirmar que mientras en pacientes con fenotipo EM es suficiente la administración de la dosis normal de 20 mg de tamoxifeno, en las de fenotipo PM debería aumentarse la dosis a 40 mg. - También se ha estudiado la concentración de los metabolitos del tamoxifeno, y podemos afirmar que los niveles del fármaco y sus metabolitos en sangre, medidos por MLC, se pueden correlacionar directamente con la posible respuesta y/o toxicidad del tratamiento y también con su genotipo/fenotipo del CYP2D6, dentro de la investigación en farmacogenética/farmacogenómica, permitiendo asociar estos cuatro parámetros: genotipo/fenotipo, concentración de endoxifeno y respuesta-evolución del paciente, alcanzando así finalmente el éxito en la personalización de los tratamientos.