Ion transport mechanisms of protein channels in model membranesfrom fundamentals to applications

Resumen

Objeto y objetivos de la investigación El objetivo principal de la presente Tesis es entender y caracterizar los mecanismos específicos por los cuales los canales iónicos mesoscópicos controlan el transporte de diferentes metabolitos a través de membranas lipídicas. Para llevar a cabo este estudio se utiliza la porina bacterial OmpF de la bacteria E. coli como sistema modelo, siendo los objetivos específicos del estudio los siguientes: 1. Caracterización de los mecanismos de transporte del canal OmpF, investigando propiedades concretas que incluyen: a. Efecto de la concentración de sal en la corriente del canal para sales de cationes monovalentes y divalentes, utilizando el análisis de las fluctuaciones de la corriente. b. Modulación de la conductancia del canal por el pH en sales de iones monovalentes mediante medidas de corriente con OmpF wild type y mutantes y medidas dependientes de la temperatura que permiten analizar el mecanismo de sensibilidad al pH del canal. c. Los mecanismos moleculares detrás de la inversión de selectividad de catiónica en sales de iones monovalentes a aniónica en sales de cationes divalentes, centrándose en la caracterización de la sensibilidad al pH de la selectividad. 2. Modulación de la corriente del canal OmpF para crear dos tipos diferentes de dispositivos rectificantes: a. Un ratchet molecular con respuesta de alta frecuencia. b. Un dispositivo capaz de bombear iones potasio en contra de un gradiente de concentración externo. 3. Aplicación del estudio realizado previamente de las propiedades fundamentales del canal OmpF en un sistema diferente (el canal VDAC de la membrana externa de la mitocondria) para investigar las propiedades de la interacción específica entre el canal VDAC y una proteína citosólica: la tubulina. Planteamiento y metodología utilizados El estudio de las propiedades de transporte de los canales OmpF y VDAC que se lleva a cabo en la presente Tesis se realiza mediante medidas electrofisiológicas experimentales y estudios teóricos de diferentes tipos (modelos electrostáticos continuos, análisis espectral, análisis termodinámico, modelos de física estadística, etc.). El procedimiento experimental utilizado se basa en la técnica conocida como voltage¿clamp. La metodología empleada consiste en reconstituir el canal en una bicapa de lípido artificial. Para ello, se utiliza una celda dividida en dos partes, cada una de las cuales tiene una capacidad de aproximadamente 2 ml. Entre las dos partes se coloca, sellada con silicona, una lámina de teflón de 12 o 15 ¿m de espesor a la que previamente se le ha realizado un orificio de entre unos 100-200 ¿m de diámetro. En este agujero se formará la bicapa de lípido en la que posteriormente se reconstituirá el canal iónico. Aportaciones originales Aunque el uso de experimentos de electrofisiología mediante reconstitución de canales en bicapas planas es un procedimiento estándar para el estudio de las propiedades de transporte de canales mesoscópicos, sí que resulta una aportación novedosa la combinación de estos estudios experimentales con diferentes tipos de análisis teóricos como son los modelos electrostáticos continuos, el análisis espectral, los modelos estadísticos y el análisis termodinámico, con el objetivo final de comprender el efecto del pH y de los iones monovalentes y divalentes en el comportamiento del canal OmpF y así obtener una perspectiva general de los mecanismos de transporte iónicos en canales mesoscópicos. También resulta novedoso el uso de un canal iónico de origen biológico para su conversión en un dispositivo rectificante que permite aplicaciones tan variadas como el diseño de un ratchet molecular de alta frecuencia o de una bomba de iones potasio en contra del gradiente de concentración externo. Por último, cabe destacar el uso de lípidos con diferentes cargas para la reconstitución del canal VDAC y el estudio de su interacción con la tubulina, lo que ha permitido mejorar la comprensión de este fenómeno en particular y de las interacciones proteína ¿ proteína en general. Conclusiones obtenidas y futuras líneas de investigación Los resultados presentados en esta Tesis proporcionan nuevas evidencias acerca de los mecanismos de transporte en canales mesoscópicos que contribuyen a un mejor entendimiento de la regulación del transporte iónico en estos sistemas. A continuación se enumeran las principales conclusiones obtenidas: 1. El canal OmpF presenta principalmente dos regímenes de transporte, dependiendo de la concentración de la disolución. A concentraciones bajas, las cargas fijas del canal controlan el transporte iónico, siendo la condición de electroneutralidad la que dicta el comportamiento del canal. A concentraciones de electrolito altas, un binding site de cationes regula las propiedades de transporte del canal tanto para sales de cations monovalentes como para divalentes. 2. La extraña regulación de la corriente del canal por el pH en sales de iones monovalentes va más allá de una simple neutralización de residuos, explicándose por la existencia de un binding competitivo entre protones y cationes en la constricción central del canal. Este mecanismo tan particular implica pequeños cambios en la energía libre del sistema debido a la existencia de un fenómeno de compensación entalpía-entropía. La barrera entálpica proveniente del binding competitivo es compensada por una ganancia entrópica debida a la multiplicidad de configuraciones microscópicas disponibles que involucran a ligandos, receptores y el disolvente del entorno. 3. La inversión de selectividad de catiónica en sales de iones monovalentes a aniónica en sales de cationes divalentes se explica por un desplazamiento notable de los pKa efectivos de residuos ácidos clave. El binding de cationes divalentes en la constricción central del canal es el responsable de este desplazamiento, que viene regulado por la concentración de electrolito y la particular química entre los cationes divalentes y los residuos ácidos implicados. 4. La corriente del canal OmpF puede ser modulada a voluntad para convertir esta porina de difusión general en un diodo nanofluídico con funciones específicas y ajustables. En concreto, el canal OmpF puede ser transformado en un ratchet molecular capaz de trabajar a frecuencias considerablemente altas mediante la adición en concentraciones milimolares de iones lantano a la disolución. Además, el dispositivo puede ser controlado de manera muy sencilla mediante el ajuste del pH de la disolución. Asimismo, el canal OmpF puede utilizarse para bombear iones potasio contra un gradiente externo de concentración mediante la inducción de condiciones asimétricas de pH en las disoluciones externas. En este caso, la selectividad catiónica del canal es decisiva para obtener el transporte contra gradiente, como se deduce del análisis detallado de las propiedades de rectificación del canal. 5. El estudio de los mecanismos de transporte se aplica finalmente a un sistema diferente, el canal VDAC, para demostrar que la interacción de esta porina mitocondrial con la tubulina dimérica depende significativamente de la carga de la superficie de la membrana lipídica. La moderada selectividad catiónica del canal en el estado bloqueado por tubulina, conjuntamente con la reducida distancia entre el camino que siguen los iones y el lípido de alrededor explica por qué la corriente del estado bloqueado por tubulina es mayor cuanto más negativamente cargado es el lípido usado para la formación de la membrana. Los resultados obtenidos en la presente Tesis profundizan en la comprensión de los mecanismos de transporte en canales mesoscópicos y dan pie a futuras investigaciones tanto en el plano fundamental (estudiando otros fenómenos de transporte, por ejemplo la inversión de carga del canal por cationes monovalentes), como en la búsqueda de futuras aplicaciones biotecnológicas (rectificación en nuevas condiciones, bombeo de aniones, etc.).