Implicaciones del estrés oxidativo en la infertilidad masculinaanálisis de marcadores bioquímicos en plasma seminal y su asociación con parámetros del seminograma y la capacitación espermática

Zusammenfassung

Aproximadamente el 15% de todas las parejas que tratan de concebir son estériles. El factor masculino contribuye en la mitad de los casos, y no se puede hallar ninguna causa identificable en más del 25% de los varones estériles (Collins et al., 1995; Guzick et al., 1998; Jungwirth et al., 2012). Algunas evidencias sugieren que el daño que provocan las especies reactivas de oxigeno (EROs) a los espermatozoides contribuye significativamente en un 30-80% de los casos de infertilidad. Las EROs son agentes oxidantes altamente reactivas y forman parte de los radicales libres. Aunque las EROs están involucradas en muchas funciones fisiológicas de los espermatozoides humanos, el exceso de producción conlleva el estrés oxidativo. Las EROs pueden causar infertilidad fundamentalmente a través de dos mecanismos: En primer lugar, EROs dañan la membrana espermática lo cual se traduce en una reducción de la movilidad y de la capacidad de fusionarse con el oocito. En segundo lugar, EROs directamente causan daño en el ADN de los espermatozoides, lo que produce un aumento de la apoptosis de estas células o bien compromete la contribución genómica paterna en el embrión. La generación de estrés oxidativo en el eyaculado es el resultado del desequilibrio entre las defensas antioxidantes y un exceso en la producción de EROs que puede proceder de los leucocitos infiltrados en el semen o de los propios espermatozoides.(Tremellen, 2008; Agarwal et al., 2012; Hamada et al., 2013). Por tanto, la presencia de estrés oxidativo puede ser evaluada a través de dos vías: a) determinación de los diferentes agentes de oxidación y antioxidación b) valoración de los daños que produce en los componentes esenciales del espermatozoide para realizar sus funciones de cara a la fecundación del óvulo. En el estudio de los agentes oxidantes, muchos autores apuntan a varios aspectos: el estilo de vida (tabaco, consumo excesivo de alcohol, obesidad, estrés psicológico, deficiencias dietéticas, edad avanzada para la procreación), consumo de fármacos, factores ambientales (exposición a pesticidas, herbicidas o metales pesados), infecciones (sistémicas o del tracto genito-urinario), o enfermedades crónicas como la diabetes o la inflamación crónica. Dentro del apartado de los metales pesados, elementos como el aluminio (Al), mercurio (Hg), plomo (Pb), cromo (Cr), cadmio (Cd), vanadio (V) o níquel (Ni), pueden resultar tóxicos incluso en pequeñas cantidades (Domar et al., 2000; Shen et al., 2000; Elejalde, 2001; Massnyi et al., 2003; Agarwal et al., 2006; Aitken et al., 2008; Fontes et al., 2008; Hammoud et al., 2008; Tremellen, 2008; Bloomer et al., 2009; Makker et al., 2009; Martínez, 2011; Wong et al., 2011; Agarwal et al., 2012). Entre los estudios que determinan la concentración de estos metales en plasma seminal se encuentran diversos resultados, aunque algunos trabajos no son muy actuales y la mayoría se han realizado en animales(Mínguez-Alarcón et al., 2012). Dentro del estudio de los agentes de antioxidación, el semen humano contiene antioxidantes intra y extracelulares para protegerse contra los radicales libres. Los más importantes son: - Antioxidantes enzimáticos: Superóxido dismutasa (SOD), glutatión peroxidasa (GPx) y catalasa, que transforman los radicales libres en moléculas menos perjudiciales. Se conoce muy poco sobre los sistemas enzimáticos involucrados en la neutralización de estrés oxidativo en el espermatozoide (Alba et al., 2000; Agarwal et al., 2005a; Khosrowbeygi et al., 2007; Tremellen, 2008; Makker et al., 2009; Zelen et al., 2010). - Antioxidantes no enzimáticos - Vitamina C: se encuentra en concentraciones muy superiores a las del plasma sanguíneo (Makker et al., 2009; Agarwal et al., 2011; Shiva et al., 2011) - Vitamina B12. Se ha demostrado que una suplementación de antioxidantes en pacientes infértiles, con niveles elevados de ROS o bajos de antioxidantes, mejora la calidad espermática (Boxmeer et al., 2007). - Minerales: Metales como el cobre (Cu), zinc (Zn), manganeso (Mn), hierro (Fe), selenio (Se), resultan esenciales ya que actúan como cofactores de actividades enzimáticas antioxidantes. En relación con los daños que el estrés oxidativo produce en los componentes esenciales del espermatozoide (lípidos de la membrana y ADN), se puede medir por medio de un marcador bioquímico de oxidación: el malondialdehido (MDA) (Rodrigo, 2009). Los espermatozoides presentan una membrana de composición lipídica altamente específica, que es la responsable de su flexibilidad y función. Por otro lado, los lípidos espermáticos son los principales sustratos para la peroxidación, lo que podría dar lugar a que se produzcan desórdenes funcionales severos en los espermatozoides. Todos los componentes lipídicos localizados en la membrana de los espermatozoides intervienen en la regulación de la maduración espermática, espermatogénesis, capacitación y en la reacción acrosómica, y eventualmente en la fusión de las membranas. Obviamente la peroxidación de los lípidos espermáticos distorsiona todas estas funciones y puede incluso inhibir la espermatogéneis (Elejalde, 2001; Rodríguez et al., 2001). Los peróxidos lipídicos, derivados de ácidos grasos polinsaturados, son inestables y se descomponen para formar una serie de compuestos complejos. Una de las consecuencias biológicas de los efectos nocivos que produce el estrés oxidativo en los espermatozoides puede ser evaluada a través de los resultados del seminograma y de la capacitación espermática. No existen estudios sobre la posible influencia del estrés oxidativo en la incapacidad de fecundar que presentan algunos sémenes teóricamente normales. Además, no se ha valorado qué variables relacionadas con los agentes oxidantes y antioxidantes previamente descritos tienen una mayor influencia en la infertilidad masculina. En las unidades de reproducción asistida no existe un protocolo establecido del estudio de estrés oxidativo en el hombre, ni tampoco rangos de referencia de algunos marcadores de estrés oxidativo en este tipo de espécimen. Por tanto, las parejas participan en técnicas como la fertilización in vitro o la inseminación intrauterina (IA) (con elevados costes económicos y no exentas de riesgo) que muchas veces pueden no tener el resultado deseado. El daño oxidativo del ADN espermático no mejora con la fertilización in vitro o la inseminación y sin embargo, el tratamiento directo del estrés oxidativo puede permitir tener una concepción natural o mejorar el rendimiento de un IA. OBJETIVO: Determinar si la presencia del estrés oxidativo, evaluado a través de la concentración de oxidantes y antioxidantes en plasma seminal de varones estériles, afecta a la calidad seminal, valorada a través de la realización del seminograma, así como el rendimiento de las técnicas de capacitación espermática y el daño en componentes esenciales del espermatozoide. METODOLOGIA. - Diseño: Se trata de un estudio descriptivo transversal. - Sujetos a estudio: Varones que acudieron a la Consulta Externa de Reproducción del Servicio de Ginecología y Obstetricia del Hospital General Universitario de Elche. Se incluyeron todos aquellos pacientes que no habiendo tenido descendencia en los dos años previos se remitieron por el Servicio de Ginecología y Obstetricia al Laboratorio de Andrología para estudio y análisis del semen y que aceptaron participar en el estudio a través del documento de ¿Consentimiento Informado para la Donación voluntaria de muestras de semen¿ elaborado para tal fin. Se excluyeron los sémenes de los pacientes que no siguieron las condiciones preanalíticas definidas por el laboratorio. Los pacientes se fueron incorporando consecutivamente y participaron aportando muestras de semen que fueron analizadas dentro de los protocolos analíticos del Servicio de Análisis Clínicos, además de practicárseles las determinaciones del presente proyecto. - Variables a estudio: Resultados del seminograma estándar, resultados del estudio de capacitación espermática, y marcadores de estrés oxidativo que incluye metales (Fe, Al, Cu, Zn, Mn, Se, Hg, Co, Cr, Cd, V, Pb y Ni), antioxidantes (enzimas y vitaminas), MDA como marcador de lipoperoxidación y respuestas al cuestionario sociodemográfico y clínico. - Recogida y análisis de datos: Los resultados se informatizaron en una base de datos para su análisis estadístico. Utilizamos el paquete estadístico IBM-SPSS 17.0 y el programa MedCalc 11.3.0. CONCLUSIONES 1. Se optimizaron las diferentes técnicas utilizadas para la determinación de los marcadores de estrés oxidativo en el plasma seminal. Todas ellas presentaron una aceptable repetibilidad, reproducibilidad, exactitud, linealidad y límite de detección. Consideramos la determinación de la SOD la técnica menos exacta, por presentar un límite de tolerancia del 16,5%. Queda demostrada la aplicabilidad de estas técnicas para la evaluación del estatus oxidativo en el plasma seminal de los pacientes sometidos al estudio de la infertilidad masculina. 2. El metal presente en mayor concentración en el plasma seminal de los varones de nuestro estudio es el Zn, seguido, con mucha diferencia por el Fe, el Se y el Cu. Los que se encuentran en menor concentración son el Hg y el Cd. Según nuestros resultados, los metales que se comportaron claramente como oxidantes son el Al, el Hg, el Ni y el Co (>0.4 µg/L), como antioxidantes el Cu, el Fe, el Mn, el Se, el Zn y el Co (0,2 - 0,4 µg/L), como modulador de la actividad antioxidante el Cd, y con carácter ambiguo el Cr, el Pb y el V. Todos ellos influyen en los parámetros seminales ya sea directa o indirectamente y, por tanto, en la calidad seminal. 3.Los varones de nuestra serie presentan unas concentraciones de antioxidantes en plasma seminal superiores a los descritos en la bibliografía en el caso de la SOD, la GPx y la vitamina B12, pero similares para el folato e inferiores para la vitamina C y la catalasa. Además, de los antioxidantes estudiados, los que demuestran de forma más directa su acción antioxidante en el plasma seminal son la SOD y la vitamina B12. 4.Existen diferencias en el estatus oxidativo entre los grupos de sujetos considerados en el presente estudio. En función de la calidad seminal, según los criterios de la OMS 1999, observamos que los varones que cumplen dichos criterios presentan mayor concentración de Mn, vitamina B12 y SOD, pero menor de Ni. Además forman parte del grupo de varones que no han tenido hijos previamente ni han nacido en España. Aquellos sujetos con un REM mayor o igual a 10 x106, es decir, que sus sémenes capacitan bien, presentan una mayor concentración de GPx y un mayor porcentaje de concentraciones de Co entre 0,2 y 0,4 µg/L. En cuanto a los grupos creados en función de la peroxidación lipídica, los varones sin lipoperoxidación en el plasma seminal se caracterizan por disponer de un mayor porcentaje de vitalidad espermática, concentración de Co menor de 0,2 µg/L, Pb mayor a 0,2 µg/L, y una concentración de V superior, pero de vitamina C y GPx inferior a los sujetos sin lipoperoxidación. También existe mayor lipoperoxidación entre los varones exfumadores. 5.De los hábitos de vida estudiados, los que influyen directamente en la calidad seminal son el país de nacimiento y la edad, con peores resultados en los varones nacidos en España y los más jóvenes. Hábitos como el consumo de tabaco, la realización de ejercicio físico y la frecuencia del consumo de determinados alimentos, influyen indirectamente aumentando los oxidantes y disminuyendo los antioxidantes en el plasma seminal. Finalmente, el consumo de drogas influye negativamente tanto directa como indirectamente en la morfología espermática. 6.Determinados parámetros del EO presentan valor diagnóstico predictivo para las principales características seminales tras la aplicación de un modelo logístico específico. Para conocer si el semen cumplirá con los criterios de la OMS 1999 se podrían utilizar como predictores el Ni y el Mn y se aplicaría el punto de corte de 0,75. Para predecir si el semen del varón presentará una buena capacitación (REM¿10 x106) se podría utilizar la motilidad progresiva, el porcentaje de las formas normales y los niveles de la actividad GPx, y aplicaríamos el punto de corte de 0,533. Por último, para conocer la lipoperoxidación presente en el plasma seminal de los varones se determinaría la vitamina C y el Co y utilizaríamos como punto de corte 0,513. 7.En base a nuestros resultados proponemos un algoritmo diagnóstico para tratar de simplificar el estudio andrológico. Para conocer si un varón presentará un seminograma con los 4 parámetros más importantes dentro de los valores de referencia de la OMS 1999, bastaría con determinar en el plasma seminal el Ni y Mn como cribado o confirmación, sólo en el caso de obtener un valor mayor de 0,75 en el modelo logístico procedería realizar el seminograma para identificar los parámetros afectados. Si lo que queremos conocer es la lipoperoxidación presente, sería suficiente con determinar la vitamina C y el Co en plasma seminal. Y, por último, para saber si el semen capacitará bien y decidir qué tipo de TRA aplicar, conociendo la motilidad y la morfología, bastaría con determinar la GPx, y dejaríamos la capacitación sólo para el proceso de la técnica de reproducción asistida. 8.En el caso de que el varón presente estrés oxidativo, según los parámetros que se vean afectados podremos intervenir. Cuando el varón no cumpla los criterios de la OMS 1999, aconsejaremos el cese del consumo de drogas, mayor aporte de vitamina B12, y mayor práctica de ejercicio físico. Cuando lo que se pretenda sea mejorar la capacitación seminal aconsejaremos la práctica de ejercicio físico y mayor aporte vitamínico de B12. Por último, para disminuir la lipoperoxidación en el plasma seminal se deberá evitar el consumo de tabaco e incrementar el aporte de vitamina C. 9.El estrés oxidativo es causa directa o indirecta de alteraciones en los parámetros del semen, por lo que debería incorporarse su determinación al estudio andrológico de un varón con posible infertilidad. Pero es necesario un mayor conocimiento, una estandarización y simplificación de los métodos utilizados, y una propuesta de valores de referencia con los que poder trabajar.