Regulation and characterization of membrane protein channels and translocation of biologically active compounds

Resumen

Resumen de la tesis (Spanish) Objeto y objetivos de la investigación El principal objetivo de la presente Tesis es caracterizar la actividad de transporte de diferentes canales iónicos, así como regular dicha actividad de transporte. Por otro lado la Tesis abarca el estudio del transporte a través de bicapas de moléculas con alto potencial biológico. En este sentido la presente Tesis abarca diferentes sistemas de estudio que comparten la capacidad de interactuar con las membranas lipídicas dando como resultado el transporte iónico a través de la formación de poros, o bien por medio de la translocación a través de la propia membrana. Los objetivos concretos que recoge este trabajo son: 1) Estudio de la regulación del transporte iónico a través de canales mesoscópicos como la porina OmpF. Las proteínas transmembrana formadoras de canales constituyen el medio de comunicación de las células, por lo que la capacidad de regular sus funciones de transporte es clave para la construcción de dispositivos biológicos que puedan utilizarse en aplicaciones biotecnológicas varias. 2) Caracterización de la actividad de canal iónico de proteínas transmembrana procedentes de virus respiratorios. Estas proteínas conocidas como viroporinas están involucradas en el proceso de infección viral, por lo que la descripción de su actividad de canal es un paso imprescindible en la investigación de su papel en el proceso infeccioso. En esta Tesis se investiga la proteína de envuelta (E) del virus que produce el Síndrome Respiratorio Agudo y Grave (SARS), y la proteína hidrofóbica (SH) del virus Sincitial Respiratorio (h VSR). 3) Análisis de la influencia de la carga de la membrana lipídica en la actividad de canal iónico de dos canales diferentes, como son los formados por la porina OmpF y la proteína E del SARS. 4) Estudio del transporte de moléculas con propiedades anfipáticas a través de bicapas lipídicas. En este punto se investiga cómo un metalcarborano que contiene boro en su estructura es capaz de atravesar las bicapas lipídicas. Dicho metalcarborano puede ser utilizado como agente anticancerígeno en la terapia conocida como BNCT, Boron-neutron capture therapy. Planteamiento y metodología utilizados El estudio y caracterización de la regulación y transporte de las proteínas formadoras de canal se han llevado a cabo a partir de medidas electrofisiológicas experimentales. El procedimiento experimental se basa en la técnica de reconstitución de canales conocida como voltage-clamp. A partir de esta técnica la proteína formadora de canal se reconstituye en una bicapa lipídica artificial. Para conseguirlo, se utiliza una celda con dos compartimentos separados por un film de Teflón de 12 a 15 µm de grosor donde hay un orificio de unos 100-200 µm de diámetro. Es en este orificio donde el canal se reconstituye. Aportaciones originales Pese a que la reconstitución electrofisiológica de canales es una técnica que ha sido ampliamente utilizada para investigar la actividad de transporte de los canales iónicos, la presente Tesis presenta como novedad los sistemas que trata. En este sentido, la caracterización de la actividad de canal iónico de las viroporinas es un tema emergente del que actualmente hay pocas publicaciones. Por otro lado, esta Tesis también trata de correlacionar dicha actividad de canal iónico con la infección viral, es decir, se combina la reconstitución electrofisiológica con otras técnicas de biología molecular para poder analizar cómo la función de canal influye en el proceso de infección viral. También la investigación de la translocación de compuestos anfipáticos a través de bicapas lipídicas utilizando la técnica voltaje-clamp es un tema novedoso y pionero, pues hasta este momento no se había empleado esta técnica para el estudio del transporte de este tipo de moléculas a través de membranas artificiales. Por último también resulta novedoso el uso de un canal iónico para regular sus propiedades de transporte aprovechando la interacción de iones multivalentes con el canal. Conclusiones y futuras líneas de investigación Las principales conclusiones de esta Tesis doctoral son: 1) La actividad de transporte del canal OmpF puede ser regulada por la presencia de sal de lantano. Bajo la presencia de cloruro de lantano tanto la conductancia como la selectividad iónica del canal son modificadas. Así, se ha conseguido regular a voluntad la función de transporte de una canal biológico, lo cual puede tener importantes aplicaciones biotecnológicas. 2) La actividad de canal iónico de la proteína de envuelta del SARS está relacionada en la patogénesis viral. Este punto es de vital relevancia para la investigación del mecanismo de infección del virus y el posible desarrollo de vacunas. 3) Se ha descrito el primer inhibidor de la actividad de transporte para la proteína hidrofóbica del virus sincitial, lo cual tiene una gran importancia para la investigación de posibles candidatos a vacunas contra el virus. 4) Se ha descrito por primera vez la translocación de un metalcarborano a través de bicapas artificiales. Dicho metalcarborano tiene interés biomédico para su uso en radioterapia para el tratamiento de determinados cánceres. Su estudio es de vital importancia para el desarrollo de nuevas alternativas.