Evaluación de sustitutos palatinos nanoestructurados generados mediante ingeniería tisular para su utilización en el tratamiento de la fisura palatina

Resumen

TESIS DOCTORAL: EVALUACIÓN DE SUSTITUTOS PALATINOS NANOESTRUCTURADOS GENERADOS MEDIANTE INGENIERÍA TISULAR PARA SU UTILIZACIÓN EN EL TRATAMIENTO DE LA FISURA PALATINA INTRODUCCIÓN: En el tratamiento quirúrgico de la fisura palatina se han utilizando tradicionalmente colgajos de fibromucosa palatina y mucosa nasal que se suturan en línea media para separar la cavidad oral de la nasal, sin interposición de hueso. Sin embargo, la obtención de dichos colgajos locales no siempre es posible, y la cicatrización de las zonas donantes puede generar retracciones que afecten el crecimiento del maxilar. Aunque hoy en día encontramos gran variedad de opciones terapéuticas para el tratamiento de la patología de paladar, existe la necesidad de hallar sustitutos anatómicos y funcionales similares al tejido a reemplazar, y por ello los avances en Ingeniería Tisular nos abren las puertas para la utilización de tejidos elaborados en el laboratorio pudiendo reducir de este modo la morbilidad surgida en los tratamientos convencionales para dicha patología. En esta Tesis se pretende demostrar una alternativa útil para el tratamiento de los pacientes con fisura palatina, utilizando las técnicas que nos brinda la Ingeniería Tisular para la elaboración de tejidos mediante sustratos estromales realizados en el laboratorio. El Objetivo principal es la elaboración de sustitutos palatinos nanoestructurados utilizando sustratos estromales realizados en el laboratorio, y la evaluación de su viabilidad in vitro para su aplicación posterior in vivo en animales de experimentación. DESARROLLO TEÓRICO: Se ha realizado un estudio experimental prospectivo en el cual se han obtenido muestras de mucosa palatina y de tejido adiposo de animales de experimentación, para la construcción de sustitutos palatinos nanoestructurados, y su posterior evaluación de viabilidad in vitro. Los procedimientos llevados a cabo para la generación de tejidos son: 1. Obtención de cultivos de muestras. 2. Obtención de cultivos primarios nativos y transdiferenciados de células madre mesenquimales (ADSCs). 3. Evaluación de la viabilidad celular de los cultivos generados. Para construir un sustituto tridimensional completo del paladar duro, se utilizarán protocolos y técnicas de ingeniería tisular previamente diseñados por los miembros del Grupo de Ingeniería Tisular en calidad GMP y aprobados por la AEMPS para la generación de tejidos artificiales. Posteriormente, se realizó una evaluación in vivo de los constructos completos del paladar. Para ello, se utilizó el modelo de fisura palatina previamente establecido por el grupo de ingeniería tisular en el conejo de laboratorio (proyecto FIS PI10/2213), generándose un defecto completo (fibromucosa oral y hueso) y permanente del techo de la cavidad oral (paladar duro) y cubriéndose el defecto generado con uno de los siguientes tejidos: - Grupo Control negativo: defecto palatino no reparado. Grupo Control positivo: ninguna actuación. - Grupo 1: defecto palatino reparado mediante aplicación de un constructo completo de mucosa oral generado mediante ingeniería tisular. - Grupo 2: defecto palatino reparado mediante aplicación de un constructo completo de un sustituto de hueso generado mediante ingeniería. Finalmente se realizó el análisis estructural, histológico e inmunohistoquímico de los tejidos elaborados. La expresión de componentes de la matriz extracelular de los tejidos tanto ex vivo como in vivo se realizó mediante ensayos de inmunohistoquímica para marcadores de epitelio de la mucosa palatina, membrana basal y corion de la mucosa palatina, siguiendo técnicas estándar de laboratorio. Todos los resultados obtenidos con estas técnicas serán cuantificados utilizando el programa ImageJ. Para el análisis anatómico y morfo-funcional de los tejidos implantados in vivo, se utilizarán técnicas de micro-CT sobre los paladares de los animales control y de los grupos de estudio, determinándose el patrón microarquitectural tridimensional tanto de la cortical como de las trabéculas óseas, así como la posible aparición de quistes óseos o zonas de hiperosificación. CONCLUSIÓN: En resumen, todos los resultados sugieren que el uso de un sustituto óseo generado mediante ingeniería con un andamio de fibrina-agarosa, podría inducir la generación de un tejido óseo bien estructurado similar al hueso nativo, mejorando los resultados clínicos y evitando alteraciones en el crecimiento de hueso. Y todo ello da evidencia sobre la posibilidad de utilizar los tejidos elaborados mediante ingeniería tisular para la reparación quirúrgica de los defectos de paladar hendido en los pacientes. BIBLIOGRAFÍA: Alaminos, M., M. Del Carmen Sanchez-Quevedo, et al. (2006). "Construction of a complete rabbit cornea substitute using a fibrin-agarose scaffold." Invest Ophthalmol Vis Sci 47(8): 3311-3317. Alaminos, M., I. Garzon, et al. (2007). "Time-course study of histological and genetic patterns of differentiation in human engineered oral mucosa." J Tissue Eng Regen Med 1(5): 350-359. Alaminos M, S.-Q. M., Munoz-Avila JI, Serrano D, Medialdea S, Carreras I, Campos A. (2006). "Construction of a complete rabbit cornea substitute using a fibrin-agarose scaffold." Invest Ophthalmol Vis Sci 47(8): 3311-3317. Badylak SF (2007) The extracellular matrix as a biologic scaffold material. Biomaterials 28:3587-93. Bhuyan, B. K., B. E. Loughman, et al. (1976). "Comparison of different methods of determining cell viability after exposure to cytotoxic compounds." Exp Cell Res 97(2): 275-280. Camozzi V, Vescini F, Luisetto G and Moro L (2010) Bone organic matrix components: their roles in skeletal physiology. Journal of endocrinological investigation 33:13-5. Carriel V, Garrido-Gomez J, Hernandez-Cortes P, Garzon I, Garcia-Garcia S, Saez-Moreno JA, Del Carmen Sanchez-Quevedo M, Campos A, Alaminos M (2013) Combination of fibrin-agarose hydrogels and adipose-derived mesenchymal stem cells for peripheral nerve regeneration. J Neural Eng 10:026022 Clarke B (2008) Normal bone anatomy and physiology. Clinical journal of the American Society of Nephrology : CJASN 3 Suppl 3:S131-9. Couchman JR and Pataki CA (2012) An introduction to proteoglycans and their localization. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society 60:885-97. Carriel V, Garzon I, Campos A, Cornelissen M and Alaminos M (2014) Differential expression of GAP-43 and neurofilament during peripheral nerve regeneration through bio-artificial conduits. J Tissue Eng Regen Med. Cho HH, P. H., Kim YJ, Bae ChJ, Shu KT, Jung JS. (2005). "Induction of osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cell by histone deacatylase inhibitors." J. of Cell. Biochem. 96: 533-542. De Souza Merli LA, de Medeiros VP, Toma L, Reginato RD, Katchburian E, Nader HB and Faloppa F (2012) The low level laser therapy effect on the remodeling of bone extracellular matrix. Photochemistry and photobiology 88:1293-301. De Ugarte DA, A. Z., Zuk PA, Elbarbary A, Zhu M, Ashjian P, Benhaim P, Hedrick MH, Fraser JK (2003). "Differential expression of stem cell mobilization associated molecules on multi-lineage cells from adipose tissue and bone marrow." Immunol. Lett. 89: 267-270. Eyre DR and Weis MA (2013) Bone collagen: new clues to its mineralization mechanism from recessive osteogenesis imperfecta. Calcified tissue international 93:338-47. Friedenstein, A. J., R. K. Chailakhyan, et al. (1974). "Stromal cells responsible for transferring the microenvironment of the hemopoietic tissues. Cloning in vitro and retransplantation in vivo." Transplantation 17(4): 331-340. Fujioka, M. and T. Fujii (1997). "Maxillary growth following atelocollagen implantation on mucoperiosteal denudation of the palatal process in young rabbits: implications for clinical cleft palate repair." Cleft Palate Craniofac J 34(4): 297-308. Garzon, I., M. C. Sanchez-Quevedo, et al. (2009). "In vitro and in vivo cytokeratin patterns of expression in bioengineered human periodontal mucosa." J Periodontal Res 44(5): 588-597. Garzon, I., D. Serrato, et al. (2009). "In vitro cytokeratin expression profiling of human oral mucosa substitutes developed by tissue engineering." Int J Artif Organs 32(10): 711-719. Garzon I, Miyake J, Gonzalez-Andrades M, Carmona R, Carda C, Sanchez-Quevedo Mdel C, Campos A and Alaminos M (2013) Wharton's jelly stem cells: a novel cell source for oral mucosa and skin epithelia regeneration. Stem cells translational medicine 2:625-32. Gentili C and Cancedda R (2009) Cartilage and bone extracellular matrix. Current pharmaceutical design 15:1334-48. Gupta, D. M., N. J. Panetta, et al. (2009). "The use of polymer scaffolds in skeletal tissue engineering applications." J Craniofac Surg 20(3): 860-861. Hattori H, M. K., Sato M, Ishihara M, Asazuma T, Takase B, Kikuchi M, Nemoto K, Ishihara M. (2006). "Bone formation using human adipose tissue derived stromal cells and a biodegradable scaffold." J. Biomed. Mater. Res. Part B: Appl. Biomater. 76(B): 230-239. Ishikawa H, Nakamura S, Misaki K, Kudoh M, Fukuda H and Yoshida S (1998) Scar tissue distribution on palates and its relation to maxillary dental arch form. Cleft Palate Craniofac J 35:313-9. Ito, S., M. Noguchi, et al. (2006). "Speech evaluation and dental arch shape following pushback palatoplasty in cleft palate patients: Supraperiosteal flap technique versus mucoperiosteal flap technique." J Craniomaxillofac Surg 34(3): 135-143. Jansen, R. G., A. M. Kuijpers-Jagtman, et al. (2008). "Collagen scaffolds implanted in the palatal mucosa." J Craniofac Surg 19(3): 599-608. Lin, Y., E. Luo, et al. (2005). "Molecular and cellular characterization during chondrogenic differentiation of adipose tissue-derived stromal cells in vitro and cartilage formation in vivo." J Cell Mol Med 9(4): 929-939. Liu, J., E. N. Lamme, et al. (2008). "Cleft palate cells can regenerate a palatal mucosa in vitro." J Dent Res 87(8): 788-792. Lo KW, Ulery BD, Ashe KM and Laurencin CT (2012) Studies of bone morphogenetic protein-based surgical repair. Advanced drug delivery reviews 64:1277-91. Luitaud C, Laflamme C, Semlali A, Saidi S, Grenier G, Zakrzewski A and Rouabhia M (2007) Development of an engineering autologous palatal mucosa-like tissue for potential clinical applications. J Biomed Mater Res B Appl Biomater 83:554-61. Llames, S., E. Garcia, et al. (2006). "Clinical results of an autologous engineered skin." Cell Tissue Bank 7(1): 47-53. Moreau, J. L., J. F. Caccamese, et al. (2007). "Tissue engineering solutions for cleft palates." J Oral Maxillofac Surg 65(12): 2503-2511. Martin-Piedra, M.A., Garzon, I., Oliveira, A.C., Alfonso-Rodriguez, C.A., Carriel, V., Scionti, G. et al. Cell viability and proliferation capability of long-term human dental pulp stem cell cultures. Cytotherapy. 2014;16:266¿277. Navarro, F. A., S. Mizuno, et al. (2001). "Perfusion of medium improves growth of human oral neomucosal tissue constructs." Wound Repair Regen 9(6): 507-512. Nieto-Aguilar, R., D. Serrato, et al. "Pluripotential Differentiation Capability of Human Adipose-derived Stem Cells in a Novel Fibrin-agarose Scaffold." J Biomater Appl. Nikitovic D, Aggelidakis J, Young MF, Iozzo RV, Karamanos NK and Tzanakakis GN (2012) The biology of small leucine-rich proteoglycans in bone pathophysiology. J Biol Chem 287:33926-33. Oliveira AC, Garzon I, Ionescu AM, Carriel V, Cardona Jde L, Gonzalez-Andrades M, Perez Mdel M, Alaminos M and Campos A (2013) Evaluation of small intestine grafts decellularization methods for corneal tissue engineering. PloS one 8:e66538 Ophof R, M. J., Kuijpers-Jagtman AM, Von den Hoff JW. (2008). "Implantation of tissue-engineered mucosal substitutes in the dog palate." Eur J Orthod 30(1): 1-9. Panetta NJ, Gupta DM, Slater BJ, Kwan MD, Liu KJ and Longaker MT (2008) Tissue engineering in cleft palate and other congenital malformations. Pediatr Res 63:545-51. Reed CC and Iozzo RV (2002) The role of decorin in collagen fibrillogenesis and skin homeostasis. Glycoconjugate journal 19:249-55. Rheinwald, J. G. and H. Green (1975). "Serial cultivation of strains of human epidermal keratinocytes: the formation of keratinizing colonies from single cells." Cell 6(3): 331-343. Sanchez-Quevedo, M. C., M. Alaminos, et al. (2007). "Histological and histochemical evaluation of human oral mucosa constructs developed by tissue engineering." Histol Histopathol 22(6): 631-640. Scionti G, Moral M, Toledano M, Osorio R, Duran JD, Alaminos M, Campos A and Lopez-Lopez MT (2014) Effect of the hydration on the biomechanical properties in a fibrin-agarose tissue-like model. Journal of biomedical materials research Part A 102A:2573¿2582. Sharma B and Elisseeff JH (2004) Engineering structurally organized cartilage and bone tissues. Ann Biomed Eng 32:148-59. Shi B and Losee JE (2014) The impact of cleft lip and palate repair on maxillofacial growth. International journal of oral science. Tavakolinejad S, Ebrahimzadeh Bidskan A, Ashraf H and Hamidi Alamdari D (2014) A glance at methods for cleft palate repair. Iranian Red Crescent medical journal 16:e15393. Teixeira, A. I., P. F. Nealey, et al. (2004). "Responses of human keratocytes to micro- and nanostructured substrates." J Biomed Mater Res A 71(3): 369-376. Vinuela-Prieto JM, Sanchez-Quevedo MC, Alfonso-Rodriguez CA, Oliveira AC, Scionti G, Martin-Piedra MA, Moreu G, Campos A, Alaminos M and Garzon I (2014) Sequential keratinocytic differentiation and maturation in a three-dimensional model of human artificial oral mucosa. J Periodontal Res. Walgenbach, K. J., M. Voigt, et al. (2001). "Tissue engineering in plastic reconstructive surgery." Anat Rec 263(4): 372-378. Yang S., L. K., Du Z., Chua C. (2001). "The design of scaffolds for use in tissue engineering: Part I. Traditional factors." Tissue Eng. 7(6): 679-689. Yoshimura K, S. K., Aoi N, Kurita M, Inoue K, Suga H, Eto H, Kato H, Hiroi T, Harii K. (2008). "Cell assisted lipotransfer